МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
ГОМЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Медико-диагностический факультет
Кафедра клинической лабораторной диагностики
Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов
Курсовая работа
Исполнитель: Подстреха Елена Станиславовна
студентка группы Д-503
Научный руководитель: заведующая кафедрой, доктор медицинских наук, доцент Новикова Ирина Александровна
ГОМЕЛЬ 2016г
Реферат
В работе проведен анализ литературы об исследовании ферментативных и неферментативных путях образования активных форм кислорода, механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Рассмотрены анти- и прооксидантные системы защиты организма, осуществляющие баланс между возникновением, метаболизмом и утилизацией активных форм кислорода.
Курсовая работа 35 страниц, 1 таблица, 17 источников.
Перечень ключевых слов: перекисное окисление липидов, свободно - радикальное окисление, активные формы кислорода, антиоксидантная защита, малоновый диальдегид.
Перечень сокращений
Введение
Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека
1 Формы свободных радикалов в организме
2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль
3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления
4 Регуляция свободно-радикального окисления
5 Система антиоксидантной защиты организма
6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем
Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов
1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека
2 Диагностика процессов перекисного окисления
Заключение
Перечень условных обозначений
АОА - антиоксидантная активность
АО - антиоксидант
АФК - активные формы кислорода
ГР - глутатионредуктаза
ГП - глутатионпероксидаза
МП - миелопероксидаза
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СОД - супероксиддисмутаза
СРО - свободно-радикальное окисление
ХЛ - хемилюминесценция
ЭПР - электронный парамагнитный резонанс
Введение
перекисный окисление липид активный кислород
В организме в результате окислительно-восстановительных реакций постоянно происходит генерация активных форм кислорода (АФК), которые обладают высокой реакционной способностью, вызывая, в частности, окислительную модификацию биополимеров: белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов. Радикалы кислорода, несмотря на свою реакционность и потенциальную токсичность, в малых концентрациях являются нормальными метаболитами множества биохимических реакций в клетке. В физиологических условиях свободно-радикальные реакции протекают на низком уровне. Процессы, протекающие с участием радикалов кислорода, свидетельствует о важной роли этих соединений в поддержании гомеостаза, формировании резистентности организма против инфекций, обеспечении регенерации тканей и органов. Если процесс генерации АФК усиливается, это может явиться и является пусковым фактором развития целого перечня разнообразных патологических процессов.
Актуальность углубленной разработки проблемы патогенетической значимости свободнорадикального перекисного окисления обуславливается нарастающим экологическим неблагополучием. Изучение этого важного звена гомеостаза имеет непосредственное прикладное значение, т. к. позволяет разрабатывать и применять адекватные профилактические подходы, предупреждающие запуск цепной реакции свободнорадикального окисления или нейтрализующие токсичность продуктов ПОЛ.
1. Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека
Системы, участвующие в образовании АФК, и процессы, связанные с окислительной альтерацией биологических соединений, условно объединены понятием прооксидантная система.
К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа.
Окислительные реакции - основа энергообразования и жизнедеятельности всех клеток организма человека. Они могут протекать без присоединения кислорода (оксидазные реакции) и с присоединением молекулярного или атомарного кислорода - оксигеназные реакции. Промежуточными продуктами последних является перекиси и эпоксиды, поэтому такие реакции называются перекисным окислением. Оно индуцируется высокореактивными свободными радикалами.
В физиологических условиях интенсивность перекисных процессов незначительна и поддерживается на стационарном уровне благодаря многокомпонентной системе нейтрализации постоянно образующихся свободных радикалов - антиоксидантной системе.
Образование прооксидантов в тканях уравновешивается активностью внутри- и внеклеточных антиоксидантов, формируя определенный оптимальный уровень прооксидантно-антиоксидантного равновесия .
1.1 Формы свободных радикалов в организме
Известно множество окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых образуются различные виды свободных радикалов. Свободные радикалы были открыты в конце прошлого столетия. К настоящему времени их описано более 8000. Свободные радикалы являются высокоактивными соединениями, которые образуются в физиологических условиях как вторичные продукты в процессе метаболизма, а также другими путями, включая редокс-реакции, осуществляемые путем одноэлектронного переноса; гомолиз инициаторных молекул, обладающих слабой ковалентной связью, радиолиз; фотолиз, термолиз.
Многие ксенобиотики, включая различные лекарственные препараты, алкоголь и др., метаболизируются в организме, генерируя свободные радикалы. Несмотря на большое разнообразие их происхождения и структуры, свободные радикалы подразделяются на 3 большие группы: 1) радикалы реактивного кислорода (ROS); 2) радикалы реактивного азота (RNS); 3) радикалы реактивного хлора (RCS) .
Свободный радикал - это молекула, атом или группа атомов, имеющих неспаренный электрон на внешней атомной орбитали. АФК являются активными участниками большого числа химических реакций в клетках, оказывая разнообразное физиологическое действие .
Отличительные особенности свободных радикалов:
наличие неспаренного электрона на внешнем энергетическом уровне;
собственный магнитный момент;
высокая химическая активность и малое время жизни;
способность инициировать цепные реакции окисления;
Наиболее вероятно появление свободных радикалов в организме при последовательном присоединении электронов к кислороду и во время свободнорадикального перекисного окисления липидов.
Основные процессы, ведущие к образованию свободных радикалов в организме:
последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности;
микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз;
ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ;
реакции автоокисления и биосинтеза (тиолы, катехоламины и т. д.);
окисление чужеродных соединений - ксенибиотиков, некоторых лекарственных препаратов;
действие негативных факторов среды (физические и химические инициаторы окисления);
фотохимические процессы;
перекисное окисление липидов.
модификация физико-химических свойств биологических мембран;
защитные функции, окисление чужеродных соединений, микробицидное действие;
обмен веществ, аккумуляция и биотрансформация энергии;
влияние на иммунитет, передачу информации.
Наиболее распространенные в организме формы свободных радикалов:
Активные формы кислорода:
О˙2 - супероксидный анион радикал;
¹O2 - синглетная форма кислорода;
OH˙ - гидроксильный радикал;
Н2О2 - перекись водорода; Окисленные галогены: CLO˙ - гипохлорид, хлорамины;
Окислы азота: NO˙ - оксид азота;
Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: RO˙, RO2˙- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот.
2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль
Радикалы кислорода образуются в ходе процессов, связанных с транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию АФК расходуется от 1 до 5 % потребляемого кислорода. Однако эта величина может существенно возрастать при изменении кислородного бюджета организма - при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала. Супероксиданион-радикал (О˙2) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии. Радикал является относительно слабым окислителем и во многих биологических системах выступает в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений. При взаимодействии с протоном О2 переходит в гидроперекисный радикал. Кроме этого, именно он является потенциальным источником гидроксильного радикала и перекиси водорода.
Супероксиданион-радикал - более реакционноспособное соединение, чем кислород. В организме супероксиданион-радикал представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков. Из источников супероксиданион-радикала наибольший интерес представляют гемоглобин, миоглобин, восстановленный цитохром С, НАДФН-оксидазы фагоцитирующих клеток и др. Основным источником радикала в крови являются нейтрофилы, генерирующие его при ряде реакций специфического и неспецифического иммунитета. Еще один фермент, специализированный на образовании супероксиданион-радикала - это ксантиноксидаза, которая в нормальных условиях находится преимущественно в дегидрогеназной форме и может обратимо и необратимо переходить в оксидазную форму, что происходит при ишемии. Считается, что генерация радикала ксантиноксидазой необходима для метаболизма железа, регуляции тонуса сосудов и клеточной пролиферации, обеспечения микробицидного потенциала нейтрофилов. Супероксиданион-радикал - пусковое звено каскада свободно-радикальных реакций, приводящих к возникновению большинства АФК и продуктов ПОЛ. Он участвует в синтезе хемотаксических пептидов, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует действие эндотелиального фактора расслабления, может повреждать мембраны эритроцитов, ингибировать Са2+-АТФ-азу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, окислять белки сыворотки, в то же время его непосредственная цитотоксичность невелика. Для регуляции уровня О˙2 в клетках служит высокоспецифичный фермент антиоксидант - супероксиддисмутаза, которая обладает способностью существенно ускорять реакции дисмутации радикала в перекись водорода.
Перекись водорода (Н2О2). Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону О2 сопровождается образованием двухзарядного аниона О22ˉ, который переходит в НО2˙ или перекись водорода. Перекись водорода относят к окислителям средней силы; в отсутствие ферментных антиоксидантов и ионов металлов переменной валентности она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани. Перекись водорода оказывает ограниченное повреждающее действие, вызывая, в частности, нарушение гомеостаза кальция в клетке. В организме ее источниками являются реакции с участием оксидаз (ксантиноксидазой, оксидазой L-аминокислот и рядом других), переносящими два электрона на молекулу кислорода, а также реакция дисмутации супероксиданион-радикала, катализируемая супероксиддисмутазой. Эта реакция является источником почти 80 % перекиси водорода в очаге воспаления.
Перекись водорода является промежуточным продуктом при образовании большинства АФК. Н2О2 - один из источников возникновения наиболее токсичного из АФК - гидроксильного радикала. В присутствии миелопероксидазы из нее происходит образование высокореакционных гипогалоидов - НОС1, HOBr, HOJ, HOSCN. В обычных условиях клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию перекиси водорода благодаря наличию ферментов - глутатионпероксидазы и каталазы. Молекулы Н2О2 выполняют ряд регуляторных функций в клетке. Перекись может служить в качестве метаболического сигнала для индукции экспрессии генов, осуществляющих синтез структурных и функциональных белков в клетке. Гидроксилъный радикал (НО˙) является наиболее реакционноспособным и, соответственно, токсичным из всех АФК, образующихся в биологических системах. Радикал может разрывать любую углеводородную связь, при этом скорость его взаимодействия с органическими субстратами достигает величин, равных скорости диффузии (т. е. 107-1010 моль/с, что в 106 раз выше, чем для супероксиданион-радикала и перекиси водорода). По сравнению с другими АФК, НО˙ обладает наиболее высоким редокс-потенциалом, равным + 2,7, что позволяет ему атаковать и разрушать любые макромолекулы практически на месте в момент появления.
Основным источником гидроксильного радикала является реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом, с Fe2+, по схеме Н2О2 + Fe+2 → Fe+3 + ОН + ОН˙. Образование радикала также происходит в ходе окисления арахидоновой кислоты, в реакции Габер-Вейса, Осипова, при микросомальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и CoQ. Обратное восстановление Fe3+ возможно в реакции с О2, а также при взаимодействии с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и другими окисляющими соединениями. Показано, что цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений напрямую связано с образованием гидроксильного радикала в процессе радиолиза воды. НО˙ также участвует в реализации микробицидного и цитотоксического действия гранулоцитов, моноцитов и Т-лимфоцитов. Гидроксильные радикалы вызывают повреждения нуклеиновых кислот, белков, а также других клеточных структур, ингибируют ряд фракций комплемента. Они индуцируют образование органических радикалов и таким образом запускают процессы ПОЛ. Ввиду высокой неспецифичности реакций радикала с разными органическими молекулами, его взаимодействие носит цепной характер. Важно отметить, что в организме нет специализированных ферментных систем, обладающих способностью инактивировать гидроксильный радикал. Низкомолекулярные соединения, такие как урацил, мочевая кислота, салицилаты, глюкоза, диметилсульфоксид, обладают способностью ингибировать ОН˙ радикал только при достаточно высоких концентрациях. Таким образом, при целом ряде патологических состояний, сопровождающихся избыточным образованием АФК и, соответсвенно, гидроксильного радикала, организм становится практически беззащитным перед повреждающим действием этого соединения. Предотвращение повреждений клеточных структур осуществляется только за счет снижения концентрации радикалов - предшественников ОН, в частности, супероксиданион-радикала и перекиси водорода. Способностью разрушать эти радикалы-предшественники обладают СОД и каталаза.
Синглетный кислород(¹O2). Образуется при изменении спина одного из электронов р-орбитали в молекуле кислорода. Возникновение ¹O2 как сопутствующего продукта отмечено во многих ферментативных реакциях с участием СОД, каталазы и пероксидаз, а также в реакциях с участием большинства АФК. Так, в реакции разложения перекиси водорода каталазой до 1%, образующегося кислорода возникает в синглетном состоянии. Синглетный кислород обладает высокой реакционной способностью и легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями. Он часто выступает в качестве индуктора реакций ПОЛ. Хотя ¹О2 обладает цитотоксическим действием и принимает участие в реализации микробиоцидного действия гранулоцитов, его вклад в эти процессы не является определяющим. Одним из наиболее эффективных гасителей синглетного кислорода в клетке является бета-каротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 его молекул прежде, чем подвергнется окислительной деструкции .
АФК выступают в качестве вторичных посредников в процессах жизнедеятельности клеток. Включаясь в сигнальную трансдукцию, АФК влияет на ключевые звенья метаболических процессов: фосфорилирование, метаболизм Са2+, модуляция факторов транскрипции, гидролиз фосфолипидов. При любых стрессорных реакциях организма, сопровождающихся состоянием окислительного стресса, АФК участвуют в передаче сигнала от первичных посредников для запуска каскада реакций, необходимых для приспособления и выживания в экстремальных условиях. Каждая ткань обладает определенной буферной ёмкостью АОЗ. Она зависит от состояния АОЗ межклеточной жидкости и самой клетки, отдельных её компонентов. Некоторые ткани в силу особенностей своей функциональной и метаболической активности обладают высокой чувствительностью к состоянию окислительного стресса, это связано с высокой потенциальной мощностью прооксидантной системы и низкой буферной емкостью АОЗ. К таким тканям относятся мозг, сетчатка, легкие. Это обусловлено важной регуляторной функцией, которую выполняют генерируемые АФК и радикальные метаболиты в этих тканях. В мозговой ткани это связано с передачей сигналов возбуждения, возникновения потенциала действия и включения в работу синапсов. АФК - вторичные мессенджеры. Метаболический фон любой клетки зависит от характера информации, поступающей из окружающей среды. Носителями этой информации являются первичные мессенджеры: гормоны, цитокины, нейротрасмиттеры. Этот процесс осуществляется за счет клеточной сигнализации или сигнальной трансдукции. А в передачу сигнала через клеточную мембрану включаются вторичные мессенджеры. В качестве вторичных посредников принимают активное участие АФК. Они осуществляют регулирующую роль в процессах роста клеток, апоптозе, клеточной адгезии, свертывания крови и т. д. Низкие (микромолярные) концентрации АФК увеличивают рост или усиливают ответ на стимуляцию роста во многих типах клеток, а антиоксиданты подавляют нормальную клеточную пролиферацию. Низкие концентрации Н2О2 стимулируют рост фибробластов. Ингибирование СОД или глутатионпероксидазы увеличивает клеточную пролиферацию. ОН˙, являться фактором, усиливающим клеточную пролиферацию и активность митоген-активируемой протеинкиназы (МАР-киназа).
В физиологических концентрациях АФК в роли вторичных посредников образуется опосредованно через лиганд-рецепторное взаимодействие. В качестве таких лигандов могут выступать гормоны (инсулин, ангиотензин, паратиреоидный гормон, витамин Дз), цитокины, факторы роста. Образование лиганд-рецепторных комплексов сопровождается образованием АФК, которые активно включаются в сигнальную трансдукцию, влияя на ключевые звенья метаболических процессов в клетке. Первичные мессенджеры осуществляют регуляцию уровня АФК в клетке за счет активации процессов их генерации с одной стороны и снижения активности отдельных звеньев АОЗ с другой. В этом процессе активное участие принимают цитокины. Цитокины стимулируют освобождение АФК из многих типов клеток, включая фибробласты человека, эпителиальные и эндотелиальные клетки. С АФК связана передача сигнала от тромбоцитарного фактора роста, эпидермального фактора роста, трансформирующего фактора роста β-1, фактора некроза опухолей. Участие интерлейкина-1 и интерферона в сигнальной трансдукции связывают с образованием О2ˉ, а ФНО - с Н2О2.
АФК выполняют роль вторичных мессенджеров и в клетках костной ткани. ФНО, интерлейкин-1, паратиреоидный гормон и витамин Д стимулируют образование АФК за счет присутствующей в остеокластах НАДФН-оксидазы. Вазоактивный пептид (ангиотензин II) проявляет свое действие на процессы мышечного сокращения и клеточный рост гладких мышц сосудов через генерацию внутриклеточного О˙2ˉ. Источником О˙2ˉ являлись НАДН и НАДФН-оксидазы, так как оба фермента активируются ангиотензином.
АФК в качестве вторичных мессенджеров участвует регуляции обмена Са2+, стимуляции фосфолирирования белков и активации факторов транскрипции. В присутствии оксидантов увеличивается транспорт Са2+ через кальциевые-каналы и ингибируется АТФ-зависимый Са2+-насос. Оксиданты, увеличивая активность различных протеинкиназ, участвуют в регуляции многочисленных клеточных процессов, таких как митогенез, клеточная адгезия, апоптоз и т.д. Также звеном действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров является фосфолипаза А2. Её активация оксидантами сопряжена с вовлечением многих путей передачи сигнала. Арахидоновая кислота, как продукт фосфолипазы А2 , является важным медиатором таких процессов как воспаление, иммунные процессы, НАДФН-оксидазная активность, свертывание крови. Таким образом выделяют 3 возможных пути действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров на процессы в клетке, связанные с образованием сигнальных молекул: Влияние на структуру клеточных мембран. Влияние на состояние депо Са2+, что сопровождается его мобилизацией из депо и поступлением в цитозоль. Активация фосфолипазы А2 .
1.3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления
Любой радикал является индуктором свободнорадикальных реакций. Процессы свободнорадикального окисления (СРО) с участием АФК при достаточно низкой интенсивности относятся к нормальным метаболическим процессам. Радикалы кислорода индуцируют процессы ПОЛ, необходимые для процессов обновления фосфолипидов и регуляции проницаемости клеточных мембран. Важной физиологической функцией АФК является активация ряда мембранных белков и иммуноглобулинов, а также ферментов, регулирующих переключение метаболических путей и синтез макроэргических соединений в клетке. С процессами СРО непосредственно связаны окислительное фосфорилирование и скорость клеточного деления. Перекись водорода может выступать в качестве метаболического сигнала для внутриклеточных процессов, приводящих к окислению специфических SH-групп протеинкиназ. Будучи активированными, эти белки транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию групп генов, продукты экспрессии которых ответственны за различные формы защитных реакций клетки. Кроме этого, перекись обладает инсулиноподобным действием. Продукты свободно-радикальных реакций и ПОЛ участвуют в биосинтезе прогестерона, стероидных и тиреоидных гормонов, лейкотриенов, тромбоксана А2, протромбина. Важным свойством активных метаболитов кислорода и, в частности, супероксиданион-радикала, является регуляция метаболизма соединительной ткани. АФК стимулируют пролиферацию фибробластов, синтез и распад коллагена и триптофана, участвуют в метаболизме железа. Некоторые из оксигеназ, а именно группа ферментов, получивших наименование цитохрома Р-450 (в настоящее время насчитывается более сотни изоформ), помимо гидроксилирования эндогенных соединений, используют кислород и ряд АФК для детоксикации липофильных ксенобиотиков. Цитохром Р-450 зависимые монооксигеназы и сопряженная с ними электронно-транспортная система осуществляют внедрение АФК непосредственно в молекулу субстрата, что приводит к образованию окисленного, более гидрофильного продукта. В организме цитохром Р-450-зависимые монооксигеназы выполняют ряд важнейших функций. Во-первых, это окислительная биотрансформация (биосинтез или деградация) эндогенных липофильных молекул-эндобиотиков (стероидов, ретиноидов, метаболитов арахидоновой кислоты), во-вторых, биотрансформация поступающих извне химических соединений-ксенобиотиков, которые не являются участниками нормальных биохимических процессов в клетке и подлежат удалению. Основная монооксигеназная реакция всегда сопровождается образованием супероксиданион-радикала, перекиси водорода, а иногда и активных метаболитов окисляемого субстрата. Преимущественно эти ферменты представлены в эндоплазматическом ретикулуме клеток, максимально ферментная система экспрессирована в гепатоцитах, надпочечниках и половых железах . АФК участвуют в регуляции сосудистого тонуса путем ингибирования эндогенного оксида азота. Одна из радикальных форм кислорода - пероксинитрил, легко превращающаяся в исходные продукты - оксид азота и супероксиданион-радикал, является транспортной формой для N0˙, в результате чего радиус действия этой сигнальной молекулы может значительно увеличиваться. Свободнорадикальная природа пероксинитрила является причиной ослабления и нивелирования многочисленных физиологических эффектов оксида азота. Взаимодействие же закиси азота и супероксиданион-радикала сопровождается резким усилением окислительного потенциала последнего.
Метаболиты кислорода участвуют в рекциях клеточного и гуморального иммунитета как регуляторы и эффекторы этих процессов. В частности, радикалы кислорода, генерируемые оксидазами нейтрофильных гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов, играют одну из основных ролей в реализации микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия этих клеток. При этом основными эффекторами микробицидного действия являются гидроксильный радикал, перекись водорода и гипогалоиды. АФК стимулируют пролиферацию иммунокомпетентных клеток. Доказано прямое участие супероксиданион-радикала в образовании хемотаксических факторов, вызывающих активацию и миграцию лейкоцитов в очаг воспаления. Способностью вызывать синтез хемотаксических пептидов обладает и гидроксильный радикал, который одновременно с этим усиливает митогенстимулированную пролиферацию и последующую дифференцировку лимфоцитов. Многие важные процессы, такие как генерация конечных продуктов пуринового обмена и распад дофамина, сопровождаются выработкой АФК. Адренэргическая стимуляция физиологически приводит к усилению, а холинэргическая - к ослаблению продукции эндогенных АФК, противоположно изменяет редокс-потенциал клетки и создает условия для пермессивного эффекта, когда один и тоже сигнал вызывает различный ответ клеток, в зависимости от их редокс-состояния. Так, например, ФНО вызывает либо гибель клеток, либо их пролиферацию, т.к. зависимый от него фактор транскрипции срабатывает только при сдвиге окислительного потенциала клеток - мишеней. Осуществляя защитные реакции, клетки (макрофаги и гистиоциты) могут многократно усиливать продукцию АФК. При фагоцитозе происходит ″метаболический взрыв″ в фагоцитах, т.е. многократное усиление потребления энергии фагоцитирующей клеткой. Значительная часть этой энергии расходуется НАДФН - зависимыми оксидазами на образование супероксидного радикала. АФК осуществляют бактерицидный эффект в фаголизосомах, т.к. в отличие от лизосомальных гидролаз, АФК способны разрушать неповрежденные клеточные стенки бактерий и интактные мембраны клеток, кислородзависимый механизм завершающей стадии фагоцитоза более важен чем гидролитический. АФК также секретируется вовне в процессе экзацитоза, в расчете на их способность разрушать причинный агент первичной альтерации, путем перекисного окисления мембран соседних клеток, осуществляют вторичное самоповреждение и способствуют выработке эйкозанойдных медиаторов воспаления .
1.4 Регуляция свободно-радикального окисления
Скорость СРО и содержание свободных радикалов в организме в норме поддерживается на определенном уровне сложной, многоступенчатой системой регуляции. В ней можно условно выделить специфические и неспецифические факторы, значение и вклад которых меняется на различных стадиях окисления. Неспецифические факторы: механизмы, регулирующие количество и качество субстрата окисления и его доступность; факторы, влияющие на инициаторы окисления, в частности, на состояние металлов переменной валентности; физико-химические свойства биологических мембран; механизмы, поддерживающие низкое содержание O2 в тканях. Специфические механизмы: ферменты, ответственные за образование и метаболизм АФК (СОД, каталаза и др.); системы, утилизирующие перекисные продукты (глутатион-пероксидаза, глутатион-редуктаза и др.); перехватчики АФК (метионин, гистамин и др.); биоантиоксиданты (токоферол, убихинон, церулоплазмин).
1.5 Система антиоксидантной защиты организма
Исходя из свойств радикальных производных молекулярного кислорода и органических перекисей, защита организма от их пагубного воздействия является одной из важнейших задач по поддержанию гомеостаза. Систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов кислорода и продуктов ПОЛ можно условно разделить на физиологическую (механизмы, осуществляющие регуляцию доставки и поступления кислорода к клеткам) и биохимическую (собственно антиоксидантную систему организма, т. е. широкий класс химических соединений, снижающих активность радикальных окислительных процессов). Физиологический компонент системы АО защиты организма обеспечивает равновесие между интенсивностью транспорта кислорода к клеткам и метаболическими процессами по его выгодной и безопасной утилизации. Эти механизмы ограничения свободнорадикальных реакций обеспечиваются за счет: наличия каскада уровней парциального давления кислорода, понижающегося от альвеол к клеткам с 100-105 до 8-10 мм.рт. ст., то есть в 10-13 раз. снижения напряжения кислорода в некоторых субклеточных структурах в 100-1000 раз по сравнению с парциальным давлением кислорода в капиллярах. Процесс опосредован относительно большой межкапиллярной дистанцией и высоким сродством цитохромоксидазы к кислороду; редукции микроциркуляции в тканях при увеличении парциального давления кислорода в артериальной крови. Происходящий при этом так называемый «гипероксический вазоспазм» имеет несколько причин. Существенное значение придается снятию сосудорасширяющего действия СО, а также снижению активности NO-синтаз и, соответственно, снижении выработки основного фактора расширения сосудов - оксида азота. Признается также и возможность прямого сосудосуживающего действия кислорода . Биохимическую АО-систему организма условно можно разделить на специфическую и неспецифическую. Специфическая АО-система направлена на разрушение АФК и продуктов их дальнейших превращений. Действие неспецифической АО-системы связано с предотвращением условий и возможностей утечки электронов и генерации АФК в ходе окислительно-восстановительных реакций (в рамках окислительного фосфорилирования) или в процессе аутоокисления субстратов (микросомальное окисление). Патогенному воздействию ПОЛ противостоят специализированные ферментные системы и целый ряд неферментных соединений. К специфическим АО-энзимам можно отнести супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы. Эта группа ферментов локализующихся преимущественно внутриклеточно, обладает способностью разрушать свободные радикалы, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Энзимы антирадикальной защиты характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов; специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве стабилизаторов металлов, к которым относятся медь, цинк, марганец, железо и ряд других.
ОксидантыАнтиоксидантыАктивные формы кислорода: О˙2 - супероксидный анион радикал; ¹O2 - синглетная форма кислорода; OH˙ - гидроксильный радикал; Н2О2 - перекись водорода; Окисленные галогены: CLO˙ - гипохлорид, хлорамины; Окислы азота: NO˙ - оксид азота; Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: RO˙, RO2˙- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот[.Ферментные Супероксиддисмутазы Каталаза Глутатион (GSH-)-пероксидазы GSSG-редуктазы Глутатион- S-трансферазы УДФ-глюкуронилтрансферазы НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза Неферментные Глутатион а-Токоферол (витамин Е) β-Каротин Ураты Билирубин Флавоноиды Альбумин Церулоплазмин ТрансферринТаблица 1.Сводная таблица оксидантов и антиоксидантов.
Содержание АО-ферментов в различных тканях организма существенно различается. Так, их уровень и активность в клетках соединительной ткани в несколько раз ниже, чем в паренхиматозных органах. Уровень ферментативных АО в клетках находится под генетическим контролем. Так, повышение содержания супероксиданион-радикала или перекиси водорода в цитозоле клеток сопровождается активацией транскрипции генов, запускающих синтез около 40 белков, среди которых - каталаза, супероксиддисмутаза, гидропероксидаза, а также эндонуклеаза репарации ДНК. Практически все воздействия, приводящие к усилению образования АФК в клетках, индуцируют синтез ферментативных АО. В условиях гипоксии и гипероксии, т. е. состояний, усиливающих образование АФК, повышается уровень ферментных АО внутри клеток. В нормальных условиях содержание ферментных АО относительно постоянно и мало зависит от пола, отмечается некоторое снижение их уровня с возрастом. В то же время нормальное функционирование АО-системы организма и содержание ферментных АО резко нарушается при критических состояниях (ранениях, травмах, а также обширных ожогах кожи. Тяжелые травмы сопровождаются нарушением динамического равновесия прооксидантных и антиоксидантных систем, при этом содержание и активность эндогенных антиоксидантов, в том числе и АО-энзимов, резко снижается внутри и вне клеток . Как уже отмечалось, ключевым ферментом АО-защиты является супероксиддисмутаза (СОД), открытая McCord J. и Fridovich I. в 1969 г. СОД относится к классу окислительно-восстановительных ферментов и присутствует в значительных количествах практически во всех про- и эукариотических клетках. В организме человека СОД обнаружена во всех органах и тканях, причем особенно высока внутриклеточная концентрация. В крови фермент находится в следовых концентрациях, при экзогенном введении чрезвычайно быстро, в течение 5-10 минут выводится в неизмененном виде почками. Высокая концентрации СОД, сравнимая с внутриклеточной, отмечается в бронхоальвеолярной жидкости. Во внеклеточном пространстве фермент присутствует в очень малых количествах. Следствием этого в случае образования большого количества супероксиданион-радикалов во внеклеточном пространстве, например, в очаге воспаления, организм оказывается практически беззащитным перед повреждающим воздействием радикалов. Основной функцией СОД является ускорение реакции дисмутации супероксидных радикалов, образующихся в ходе биологического окисления. Скорость спонтанной реакции при нейтральных значениях рН не превышает 7 х 105 Мˉ1 сˉ1, в присутствии СОД она возрастает до 2 х 109 Мˉ1 сˉ1 и выше, т. е. фермент ускоряет реакцию на три-четыре порядка. СОД имеет несколько изоформ, различающихся строением активного центра. Железосодержащий изофермент характерен только для микроорганизмов, для клеток человека характерны две его другие разновидности. Марганецсодержащий фермент (Mn-СОД) локализован в митохондриях, цианидрезистентен. В общем объеме супероксиддисмутазной активности доля Mn-СОД невелика и составляет около 15%. До 40% СОД, сконцентрированной в ядрах клеток, приходится именно на марганцевую форму фермента, которая дисмутирует до 20% супероксидных радикалов, продуцирующихся в ядре клетки. Медь-цинковая форма энзима (Си, Zn-СОД), чувствительная к цианиду, содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий. Считается, что атом меди обеспечивает каталитическую активность, а атом цинка - стабилизацию структуры цитозольной изоформы фермента. Низкомолекулярые тиолы за счет восстановления иона Си2+, присутствующего в активном центре СОД, активируют энзим и ускоряют дисмутацию кислорода. В большинстве случаев фермент состоит из двух одинаковых субъединиц (молекулярный вес колеблется в пределах 30-40 кДа), каждая из которых содержит каталитически активный ион меди и ион цинка, связанные общим лигандом - имидазолом гистидина 61. Важнейшая роль СОД для клеточного метаболизма предопределена не только широким распространением этого фермента, но и рядом его уникальных свойств: высокой термоустойчивостью, устойчивостью к действию протеаз, денатурирующих агентов, широким оптимумом рН каталитической активности. Фермент довольно устойчив в растворах - выдерживает нагревание до 100° С в течение минуты, не теряет активности в диапазоне рН от 2 до 12. Каталаза представляет собой гемсодержащий фермент с молекулярной массой 250 кДа. Также как и СОД, каталаза представлена во всех клетках организма, однако ее уровень в различных тканях неодинаков. Высокое содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, почках и печени. В пероксисомах последних фермент составляет до 40 % всего белка. Реакция, катализируемая каталазой, в общем виде выглядит следующим образом. Скорость катализа исключительно велика: одна молекула каталазы в секунду разлагает до 44 000 молекул перекиси водорода. Активность каталазы зависит от соотношения числа дисульфидных связей к количеству сульфгидрильных групп в молекуле фермента, которые участвуют в образовании ее активного центра. Из-за этого каталаза чувствительна к действию тиоловых ядов. Из-за большого молекулярного веса молекулы энзим практически не проникает через клеточные мембраны. Это является некоторым препятствием для использования препаратов каталазы в практике. АО-ферменты СОД и каталаза, функционируя совместно, своевременно инактивируют АФК, супероксиданион-радикал и перекись водорода, образующихся в процессе нормального метаболизма клеток, а также при значительной интенсификации процессов ПОЛ. Однако данные ферменты обладают слабой активностью по отношению к липидным пероксидам, образующимся в ходе цепных реакций ПОЛ. Разрушение этих продуктов осуществляется с участием ферментной системы глутатиона. Система ферментов глутатиона. Селенсодержащая глутатионпероксидаза способна эффективно разлагать гидроперекиси липидов и перекись водорода. Ее сродство к перекиси водорода выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях перекиси, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями перекиси водорода, ключевая роль принадлежит каталазе. Глутатионпероксидаза катализирует реакцию окисления глутатиона с образованием его конъюгированной формы, в ходе реакции перекись водорода разлагается до воды.
2G-SH + Н2О2 → G-S-S-G + 2Н2О
Фермент также катализирует реакцию восстановленного глутатиона с гидроперекисями липидов, при этом последние превращаются в жирные оксикислоты:
2G-SH + ROOH → G-S-S-G + R-OH+ Н2О
Наряду с этим, глутатионпероксидаза способна восстанавливать перекиси белкового и нуклеиновокислотного происхождения. Глутатионпероксидаза локализована в цитозоле (около 70 %) и митохондриях (20-30 %) всех клеток млекопитающих. Активный центр фермента содержит четыре атома селена, ковалентно связанных в форме селеноцистеина. Недостаток селена в рационе питания сопровождается снижением активности глутатионпероксидазы в клетках и, соответственно, пониженной устойчивостью организма к окислительному повреждению. В тяжелых случаях это может приводить к развитию аналогичной авитаминозу Е свободнорадикальной патологии, для которой характерны ожирение, некробиотические изменения в печени и гемолиз эритроцитов (болезнь Кешана). Еще одним ферментом, использующим глутатион для осуществления АО-защиты, является глутатионтрансфераза. Глутатионтрансфераза содержится преимущественно в цитозоле клеток, в печени человека она составляет 2-4 % от общего количества цитозольного белка. Фермент, а точнее, группа ферментов, осуществляет конъюгацию восстановленного глутатиона с гидрофобными соединениями и восстановление органических перекисей. Элиминация производных липофильных ксенобиотиков, а также продуктов ПОЛ, в том числе гидроперекисей жирных кислот, осуществляется посредством их восстановления, нуклеофильного замещения или присоединения к молекуле глутатиона:
ROOH + 2G - SH → ROH +G - S - S - G + H 2О+G - SH →R- S - G + XH+ G - SH → HR - SG
В отличие от глутатионпероксидазы, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидропероксиды с малым размером молекулы, глутатионтрансфераза не взаимодействует с перекисью водорода, а восстанавливает гидрофобные гидропероксиды с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот - линоленовой и арахидоновой, а также фосфолипидов. Кроме этого, фермент восстанавливает гидроперекиси мононуклеотидов и ДНК, участвуя тем самым в их репарации. Глутатионтрансфераза - важный компонент АО-защиты, обеспечивающий удаление многих метаболитов окислительного стресса. Восстановленный глутатион необходим для нормальной работы глутатионзависимых ферментов. Поддержание его достаточного уровня осуществляется посредством синтеза, за счет его десорбции из связей с белками или же путем восстановления из окислений формы. Эта реакция осуществляется ферментом глутатионредуктазой, относящейся к флавопротеинам.
G-S-S-G + НАДФН + Н+ → 2G - SH + НАДФ +
Глутатионредуктазная система позволяет быстро пополнять пул восстановленного глутатиона в тканях. Основным источником НАДФН для этой реакции служит пентозный цикл окисления глюкозы, при этом НАДФ-зависимые дегидрогеназы пентозного цикла активируются окисленным глутатионом. Снижение содержания восстановленного глутатиона в тканях создает благоприятные условия для блокирования SH-групп, входящих в состав ферментов и структурных белков клетки. Считается, что глутатион является основным агентом, защищающим тиоловые ферменты от окисления. К числу тиоловых ферментов относятся многие оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы и лигазы. Окисление SH-групп нарушает функционирование глкюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, АТФ-азы, моноаминоксидазы, ксантиноксидазы, глутатионредуктазы и каталазы. Приведенные факты подтверждают мнения о том, что тиоловые соединения принимают самое непосредственное и широкое участие в механизме функционирования ферментативного звена АО-системы, выполняя не только антирадикальное, но и антиперекисное действие. Водорастворимые низкомолекулярные тиоловые соединения: глутатион и эрготионеин. Первый из них является компонентом небелковой тиолдисульфидной окислительно-восстановительной системы и представляет собой трипептид, образованный аминокислотами цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Глутатион существует и двух формах - восстановленной (до 97% от общего количества) и окисленной. Наряду с другими серосодержащими соединениями, глутатион является ингибитором АФК и стабилизирует клеточные мембраны. Ему принадлежит ведущая роль в нейтрализации гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате ридиолиза воды под действием ионизирующих излучений .
1.6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем
Нарушение сбалансированности антиоксидантной (АОС) и прооксидантной систем (ПОС) обусловливает развитие окислительного стресса (ОС). Токсическое действие АФК проявляется при состояниях ОС, который сопровождается резкой интенсификацией свободно-радикальных процессов в тканях. Это является важнейшим патогенетическим звеном развития многих воспалительных процессов, радиационных поражений, сердечно-сосудистых, онкозаболеваний, химических и других интоксикаций. Механизм генерации АФК при многих патологических состояниях носит общий характер. Некоторые отличительные особенности можно выявить только на начальных стадиях. Так, при воспалительных процессах пусковым фактором интенсификации свободнорадикальных процессов является дыхательный взрыв, при гипоксии - нарушение в первую очередь системы тканевого дыхания, при химических поражениях - активация системы микросомального окисления. Таким образом, причины, вызывающие интенсификацию свободно-радикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекулярном уровне носят однотипный характер и процессы генерации АФК взаимосвязаны. Некоторые антиоксиданты в условиях ОС могут выступать в качестве прооксидантов. При состояниях ОС возрастает восстановительный потенциал клетки за счет субстратов, коферментов в восстановленном состоянии, что приводит к снижению рН в очагах ишемии тканей сердца и головного мозга. Это создает условия для повышения пула "активных форм" металлов переменной валентности. В условиях повышеной генерации АФК они могут участвовать в реакциях, связанных с генерацией радикальных продуктов. Так, в присутствии Fe/Cu и О2 тиолы (RSH) являются источниками радикалов, RS, О2-, Н2О2 и ОН, НАДФН-радикалов НАД(Ф), аскорбиновая кислота - семидегидраскорбат радикала . Повышение уровня АФК сопряжено с интенсификацией процессов окислительной деструкции липидов, белков, нуклеиновых кислот, углеводов. Именно интенсификация этих процессов является основной причиной цитотоксического поражения тканей.
Как уже указывалось, причиной накопления активных форм кислорода являются нарушения нормального окислительного метаболизма клеток при патологии (шунтирование кислородом электротранспортных путей в митохондриях и в системе макросомального окисления при «утечке» электронов, трансформация дегидрогеназных путей в оксидазные, реакции аутоокисления, например, катехоламинов и пр.). В концентрациях, превышающих физиологические, все эти соединения являются высокотоксичными для биологических систем всех уровней, от молекулярно-клеточного до организменного. Свойство осуществлять окислительное повреждение и деструкцию компонентов живых систем, обусловленное активными производными кислорода, получило обозначение как «токсичность кислорода». Свободные радикалы кислорода являются нестойкими химическими соединениями и легко вступают в реакции с биомолекулами, вызывая их модификацию или деструкцию. Объектами неспецифических несанкционированных окислительных реакций с участием кислорода и его химически активных производных могут служить молекулы различной химической природы. АФК способны разрывать любую углеводородную связь и легко разрушают высокомолекулярные соединения: гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. В присутствии ионов двухвалентного железа АФК превращают оксигемоглобин в метгемоглобин. Окисление функциональных групп биологически активных веществ является причиной деградации структурных белков и липидов клеточных мембран и нуклеиновых кислот, ингибирования ферментов, изменения структуры и свойств гормонов и их рецепторов. Результатом взаимодействия активных производных кислорода с молекулой ДНК является структурная модификация азотистых оснований, разложение пятичленного кольца дезоксирибозы, а также расщепление сахарофосфатного остова, что в конечном итоге приводит к фрагментации этого полимера. Доказано, что избыточная выработка АФК, в частности, супероксиданион-радикала, синглетного кислорода и гидроксильного радикала, может явиться причиной ряда хромосомных аббераций и мутаций ряда генов в лимфоцитах человека. Взаимодействие АФК с белками приводит к структурным изменениям этого типа биомолекул, заключающимся в модификации боковых группировок аминокислотных остатков, фрагментации полипептидных цепей и образованию ковалентных связей внутри молекул и между ними. Толерантность белков к АФК зависит от их аминокислотного состава, к свободнорадикальному повреждению более чувствительны циклические и серосодержащие аминокислоты. Из 20 незаменимых аминокислот наиболее уязвимыми для АФК, в частности для синглетного кислорода, являются гистидин, триптофан, метионин, тирозин и цистеин. Отличительной особенностью окислительного повреждения липидов в составе клеточных мембран является то, что в гидрофобной области их жирнокислотных остатков способен аккумулироваться молекулярный кислород. В результате этого, а также тесного и параллельного расположения по отношению друг к другу соседних жирнокислотных остатков создаются условия для развития окислительных повреждений по типу цепных реакций. Из-за ключевой роли в такой экспансии органических гидроперекисей этот процесс получил наименование перекисного окисления липидов .
2. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов
Основными субстратами ПОЛ являются полиненасыщенные высшие жирные кислоты (ВЖК), находящиеся в структуре фосфолипидов мембран. На разных стадиях пероксидации ВЖК образуются диеновые и триеновые конъюгаты, пероксиды БЖК (R-ОО˙), гидроперекиси ВЖК (R-ООН), эндоперекиси, малоновый диальдегид и новые свободные радикалы. Сильнейшим катализатором процесса являются ионы металлов (Fe2+). Процесс может оборваться при образовании продуктов, не содержащих свободных радикалов.
Процессы ПОЛ можно условно подразделить на три последовательных этапа, или фазы развития: процессы зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей. На стадии зарождения цепей под действием свободных радикалов кислорода, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит образование органических радикалов (R).
О2 + R-H→R˙ + НО2
О2 + R-H→R˙ + НО2
ОН˙ + R-H → R˙ +Н2О
На следующей стадии радикал быстро взаимодействует с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате происходит образование пероксирадикала (RO2), который атакует ненасыщенные липиды. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала (R) способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер:
R + О2 → RO2;+ RH → ROOH + R Органические перекиси (ROOH) включаются в процесс генерации радикалов, в присутствии металлов переменной валентности (меди, кобальта, марганца, железа) происходит образование реакционного алкоксильного радикала:
ROOH + Me n+→RO + ОН ˉ + Me (n+1)-
Часть образующихся органических радикалов взаимодействует друг с другом, при этом происходит образование неактивных молекул, что обрывает ход реакций свободнорадикального окисления:
RO2 + R → ROOR
Гидроперекиси липидов способны подвергаться нерадикальным - окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коньюгаты, диальдегиды), промежуточных (основания Шиффа) и конечных продуктов ПОЛ, а также спиртов, кетонов и альдегидов. Обрыв цепных реакций перекисного окисления возможен при взаимодействии радикалов со специализированными ферментными системами, а также с рядом низкомолекулярных веществ, совокупно формирующих биохимический компонент антиоксидантной системы организма Избыточная активация ПОЛ может возникать как следствие резких изменений кислородного режима клетки. При этом гипероксия является причиной временного усиления процессов ПОЛ, а стойкая гипоксия ведет к лавинообразному накоплению токсичных продуктов перекисного окисления. Чрезмерная интенсивность реакций ПОЛ развивается под действием внешних воздействий, к которым можно отнести ионизирующее и ультрафиолетовое облучение, а также ряд химических веществ, относящихся к прооксидантам. Продукция АФК и, соответственно, интенсивность процессов ПОЛ в клетках резко возрастают как неспецифическая реакция при действии на организм различных стрессорных факторов химической, физической и биологической природы. В конечном итоге все эти воздействия могут приводить к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты организма и развитию окислительного стресса, проявляющегося на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Типовые патологические процессы, такие как гипоксия и воспаление, свойственные и развивающиеся при большинстве соматических и инфекционных заболеваний, тяжелых травмах и ранениях, всегда сопровождаются избыточным образованием АФК и продуктов ПОЛ Длительная активация процессов ПОЛ сопровождается развитием синдрома липидной пероксидации. При чрезмерной активации ПОЛ, когда, значительная часть мембранных фосфолипидов подвергается окислительной деградации, липидная фаза мембран становится более ригидной. Это ограничивает конформационную подвижность полипептидной цепи, вследствие чего снижается функциональная активность ферментов, рецепторов и каналообразующих белков, встроенных в мембраны, что в свою очередь препятствует удалению Са+2 из саркоплазмы и обеспечивает повреждающее действие кальция на клеточные органеллы. К настоящему времени доказана способность метаболитов ПОЛ ингибировать К+/Na+-АТФазу плазматической мембраны, вызывать цитолиз гепатоцитов с развитием ферментемии. Продукты ПОЛ нарушают нормальное функционирование кальциевых каналов L-типа, что сопровождается электролитными нарушениями в клетках миокарда. Их избыток приводит к сдвигу метаболизма арахидоновой кислоты, в результате чего одно из образующихся соединений (15-гидроарахидоновая кислота) снижает β-адренергическую стимуляцию за счет угнетения этого типа адренорецепторов. Продукты этих реакций повреждают мембраны эритроцитов, окислят альбумин сыворотки, нарушают синтез нуклеиновых кислот в клетках.
Активированные формы кислорода и продукты ПОЛ повреждают гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. Некомпенсированная антиоксидантной системой генерация активированных форм кислорода может вызвать повреждающее действие на эндотелий и базальную мембрану сосудов непосредственно или опосредованно через инактивацию антиоксидантных систем. Морфологически выявляемые гранулы липофусцина, состоящие из отложений нерастворимых липоперекисей и белков, являются продуктами ПОЛ. АФК и продукты ПОЛ способствует избыточной выработке и высвобождению ряда провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухолей, интерлейкина-1, интерлейкина-6) и медиаторов воспаления (гистамина, брадикинина, серотонина), производных арахидоновой кислоты - лейкотриенов, простагландинов и тромбоксанов. Избыточная выработка АФК и продуктов ПОЛ обусловливает резкую активацию системы комплемента по альтернативному пути с высвобождением анафилатоксина .
2.1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека
Для большинства или почти всех патологичгских состояний, течение которых сопровождается участием АФК, присуще так называемое состояние окислительного стресса, характеризующееся интенсификацией продукции этих субстанций. Следует отметить, что состояние окислительного стресса является характерным не только для заболеваний, но имеет место и при физиологическихсостояниях, близких к экстремальным - интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, а также при старении организма. Существует «свободнорадикальная теория старения», ее создатель Д. Хармен, впервые изложивший основные положения теории в 1955 г. Теория Хармана базируется на системе аргументаций, связанной со способностью свободных радикалов неспецифически повреждать такие макромолекулы, как ДНК, липиды и белки, а процесс старения связывается с накоплением таких повреждений в организме. В рамках этой теории находит объяснение не только старение ррганизма, но и широкий круг связанных со старением патологических процессов: сердечнососудистые заболевания, возрастные дисфункции мозга, иммунодепрессия, канцерогенез и другие виды патологии. При всех заболеваниях, где в качестве обязательного компонента присутствует воспалительная реакция, ведущую роль в повреждении клеток и тканей организма выполняют АФК, продуцируемые лейкоцитами, главном образом, нертрофилами. Хотя наиболее разрушительные формы АФК, генерируемые миелопероксидазой, действуют в фаголизосомах лейкоцита, однако в очаге воспаления нейтрофилы способны секретировать этот фермент и во внеклеточное пространство. Уничтожение инфекционного агента при развитии воспалительного процесса может обеспечиваться и ценой попутного повреждения собственных тканей в очаге воспаления, при этом кислородзависимое повреждение тканей носит как прямой, так и опосредованный характер. Последний реализуется при воздействии АФК на регуляторные и эффекторные молекулы, например, на протеиназы и ингибиторы протеиназ. АФК могут прямо активировать латентные формы коллагеназы секретируемые нейтрофилами, а также инактивировать универсальный ингибитор протеиназ - α2-макроглобулин и специфический ингибитор сериновых протеиназ - αı-антитрипсин. АФК, генерируемые внутриклеточно, а также проникающие внутрь через клеточную мембрану, являются пусковыми факторами индукции апоптоза.
Свободнорадикальный механизм повреждения плазматических, митохондриальных и ядерных мембран, ядерного и митохондриального генома, липопротеинов крови приводит к повреждению сосудов и гистогематических барьеров, что играет важнейшую, нередко решающую роль в патогенезе наиболее распространенных заболеваний воспалительной, токсической и аутоиммунной природы. Патогенетическая роль АФК выявлена к настоящему времени приблизительно для сотни заболеваний человека. Это имеет место при сердечно-сосудистой патологии - ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, острой артериальной непроходимости сегмента конечности, ишемических и реперфузионных поражениях почек, головного мозга и других тканей, в развитии катаракты и атеросклероза. Показано, что формирование атеросклеротических бляшек в интиме сосудов происходит при активном участии свободных радикалов, взаимодействующих с полиненасыщенными жирными кислотами. В основе патогенеза системной красной волчанки лежит повышенная чувствительность нуклеиновых кислот (в частности, ядерного ДНК) к повреждающему действию свободных радикалов. Предрасполагающим фактором заболевания является диета с избыточным количеством полиненасыщенных жирных кислот. АФК играют важную роль при бронхолегочной патологии, как при острых, так и при хронических заболеваниях (например, эмфиземе, астме и хроническом бронхите). Чрезвычайно важное значение свободные радикалы имеют в патогенезе респираторного дистресс-синдрома. Именно АФК, вырабатываемые нейтрофилами крови, отводится ведущая роль в повреждении эндотелиально-альвеолярного барьера, развитии интерстициального отека и развернутой клиники этого синдрома. Чрезмерная и длительная стимуляция ферментных систем, отвечающих за генерацию активных радикалов фагоцитов, лежит в основе механизмов формирования профессиональной пылевой болезни и таких ее осложнений, как системный коллагеноз и злокачественное перерождение клеточных элементов легких и плевры. Многолетнее ретроспективное исследование, проведенное в 23 странах под эгидой ВОЗ, выявило прямую зависимость частоты развития некоторых видов злокачественных новообразований легких, молочной железы, яичников и прямой кишки от количества потребляемых животных жиров и интенсивности процессов ПОЛ в организме . Многочисленные исследования свидетельствуют, что процессы свободнорадикального окисления лежат в основе патогенеза многих хронических заболеваний печени, причем избыточное образование АФК и продуктов ПОЛ проявляется на самых ранних стадиях процесса. Гепатотоксическое действие радикалов кислорода проявляется на мембранах клеток, являющихся основным местом синтеза супероксиданион-радикала. Усиление продукции АФК в результате индукции ксантиноксидазы интерфероном происходит даже при вирусном поражении. Радикалы кислорода повреждают мембранный аппарат гепатоцита, разрушают липидный слой его мембран, а также повреждают белки - ферменты монооксигеназной системы. Тяжесть течения и прогноз развития хронического заболевания печени тесно связаны с функциональным состоянием антиоксидантной системы гепатоцитов. Избыточная активация ПОЛ является причиной возникновения и прогрессирования гипертонической болезни. Установлено, что под влиянием АФК и продуктов ПОЛ нарушаются проницаемость клеточных мембран и активность Na+/K+-АТФазы, что приводит к накоплению в клетках ионизированного кальция. Кроме этого, вторичные продукты ПОЛ способны прямо воздействовать на тонус артериальных сосудов. Кроме сосудосуживающего действия, радикалы кислорода активируют работу фибробластов соединительной ткани, в результате чего развивается артериокапиллярный фиброз, т. е. необратимые изменения сосудов. Окислительный стресс практически всегда развивается при инфекционных заболеваниях. Избыточное образование свободных радикалов кислорода является одним из ведущих механизмов в патогенезе гриппа. Генерирование АФК определяет мутагенез и протеолитическую активность вируса гриппа, цитопатический эффект вирусной инфекции, деструкцию капиллярной сети и стенок капилляров, развитие сливных пневмоний и отека легких. Токсическое повреждение нейронов АФК, продуктами ПОЛ и окислительный стресс рассматриваются в качестве ведущего механизма при нейродегенеративных заболеваниях. Одной из причин развития рассеянного склероза могут быть митохондриальные нарушения, сопровождающиеся избыточной продукцией АФК. Активный кислород при рассеянном склерозе обладает непосредственно поражающим действием на ЦНС и является причинным фактором развития заболевания. Окислительное повреждение приводит к гибели нервных и глиальных клеток, что проявляется демиелинизацией и образованием очагов глиоза в ЦНС. В 37% случаев у людей с болезнью Паркинсона наблюдается дефектность первого комплекса дыхательной цепи в клетках черной субстанции. Постепенная кумуляция метаболитов кислорода, продуктов ПОЛ, металлопротеинов и развитие окислительного стресса в различных отделах ЦНС имеют особое значение при болезни Альцгеймера и хорее Гентингтона. Процессы накопления липофусцина в клетках ЦНС при этих состояниях соотносятся с уровнем антиоксидантных энзимов в мозговой ткани. АФК и продукты ПОЛ оказывают прямое деструктивное действие на внутренние органы и приводят к развитию полиорганной недостаточности после тяжелых травм и обширных ожогов. Радиолиз воды, образование свободных радикалов кислорода и разнообразных метаболитов ПОЛ лежат в основе патогенеза острых и хронических радиационных поражений и человека .
2.2 Диагностика процессов перекисного окисления
Четких клинических признаков избыточной активации свободнорадикального окисления в организме человека нет. Развитие окислительного стресса у пациента сопровождается: признаками дыхательной недостаточности и недостаточности кровообращения (чаще имеет место гипердинамический тип кровообращения); психомоторным возбуждением; повышением температуры более 37,5° С; выраженной болевой реакцией. Лабораторными признаками окислительного стресса авторы считают: повышение количества лейкоцитов в крови (> 10 тыс.) без палочкоядерного сдвига в ближайшее время после травмы (10-12 ч.); увеличение содержания в крови аланиновой и аспарагиновой трансаминаз; повышение концентрации глюкозы плазмы крови > 7,0 ммоль/л; некомпенсированный метаболический ацидоз (рН < 7,2); Для лабораторной диагностики выраженности окислительного стресса и определении показания для использования препаратов с антиоксидантными свойствами целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также интенсивности свободнорадикальных реакций (процессов ПОЛ) в организме пациента. Оценка состояния антиоксидантной системы обычно включает в себя определение активности основных ферментных АО (активность СОД, каталазы и глутатионпероксидазы эритроцитов), а также содержание аскорбиновой кислоты, токоферола и селена в крови. Инструментальная оценка выраженности свободнорадикальных реакций предусматривает определение в пробах крови или тканей продуктов реакций перекисного окисления, к которым относят диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, основания Шиффа и активные формы кислорода. Совокупность этих показателей позволяет оценивать как состояние основных звеньев АО-системы организма, т. е. ее способность предотвращать избыточный ход реакций свободнорадикальной природы, так и фактическую интенсивность реакций ПОЛ и синтеза АФК. Исходя из этого, данные тесты могут рассматриваться в качестве лабораторных критериев диагностики окислительного стресса. Лабораторная диагностика интенсивности ПОЛ необходима для суждения об АО-активности того или иного препарата, так как на основании клинических признаков невозможно адекватно оценить деиствие АО-препарата. Отметим, что использование только одного из указанных выше тестов не дает полной информации. Динамика показателей интенсивности свободнорадикальных реакций и содержание АО в организме порой имеют противоположную направленность. В ряде случаев колебания содержания продуктов свободнорадикальных реакций не сопровождаются изменением уровней активных форм кислорода, и наоборот. Резкая интенсификация свободнорадикальных реакций и накопление продуктов этих реакций в крови может не приводить к изменению содержания и активности основных компонентов АО-системы. Для достоверной и адекватной клинической интерпретации получаемых результатов принципиальное значение имеет не только абсолютная величина показателей, а их динамика на фоне проведения лечебных мероприятий.
Лабораторные критерии диагностики окислительного стресса Оценка состояния антиоксидантной системы пациентаОпределение интенсивности свободнорадикальных реакцийСодержание и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах или других, доступных для изучения клетках: Супероксиддисмутазы Каталазы ГлютатионпероксидазыСодержание в плазме (сывортке) крови первичных, вторичных и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов: Диеновых коньюгат Малонового диальдегида Оснований ШиффаСодержание в крови низкомолекулярных антиоксидантов: Аскорбиновой кислоты Токоферола СеленаСодержание в крови активных (радикальных) форм кислорода: Супероксиданион-радикала Синглетного кислорода Общий уровень радикаловКаждый из предложенных показателей имеет свои достоинства и недостатки. Основными требованиями, предъявляемыми к лабораторным методам, являются точность, простота выполнения и хорошая воспроизводимость. Желательными являются простота подготовки проб к исследованию и возможность их хранения, что позволяет не проводить все тесты ex tempore. Наиболее широко распространенный в экспериментальных исследованиях и клинической практике метод определения малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой не является точным показателем, отражающим течение процессов ПОЛ, так как в ходе реакции тиобарбитуровая кислота взаимодействует с веществами нелипидной природы, имеющими в своем составе кето-группу, например, с глюкозой. Взаимодействие же тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом, исходно содержащимся в липидных системах, в количественном отношении играет незначительную роль. Тем не менее на протяжении почти тридцати лет метод является наиболее употребимым большинством исследователей при изучении процессов ПОЛ в различных биологических системах. К его достоинствам можно отнести простоту и относительную быстроту выполнения, а также хорошую воспроизводимость результатов. Другими распространенными методами оценки интенсивности реакций ПОЛ является определение уровня первичных и промежуточных продуктов этих реакций, т. е. диеновых конъюгатов и оснований Шиффа. Методы точны и относительно просты для воспроизведения. К их недостаткам относится невозможность хранения отобранных проб, поэтому исследования должны проводиться сразу или в пределах получаса после их отбора. Более точным и адекватным показателем интенсивности и выраженности свободнорадикальных реакций и, соответственно, состояния анти-оксидантной системы организма, является определение АФК - основных предшественников реакций ПОЛ; быстрое и точное измерение уровня которых в цельной крови осуществляется люминесцентным методом. В зависимости от вида используемого люминофора (люминол, люцигенин и т. д.) возможно определение как отдельных видов АФК, так и их общее количество. Метод отличается быстротой выполнения, его можно рекомендовать для экспресс-диагностики. Методика позволяет хранить пробы гепаринизированной крови для исследования до 12 ч при температуре +4˚С, т. е в обычном бытовом холодильнике.
Основные показатели, характеризующие оксидантно-антиоксидантную систему. Интенсивность ПОЛ - оценивается по концентрации в крови и других биологических жидкостях промежуточных и конечных продуктов реакции. Малоновый диальдегид (МДА) - конечный продукт ПОЛ. Нормальная концентрация в крови - 2,5-6,0 мкМ/л. Зависит от метода определения, поэтому в каждой лаборатории имеется собственный референтный интервал. Увеличение концентрации - свидетельство усиленного ПОЛ и срыва антиоксидантной защиты. Определение малонового диальдегида в крови флуориметрическим методом (Федорова Т. Н., Коряцива Т. С, Ларский Э. Г.) Принцип метода: тиобарбитуровая кислота (ТБК) в кислой среде взаимодействует с низкомолекулярными диальдегидами (главным образом с малоновым) с образованием окрашенного в розовый цвет комплекса. Нормативные величины: 3,7±0,12 ед. Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Коробейников Э. Н.) Принцип метода: при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу гидроперекисей, разлагается с образованием малонового диальдегида, взаимодействие молекулы которого с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты приводит к формированию окрашенного комплекса. Нормативные величины: 3,69±0,14нмоль/л. Определение перекисей липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Гаврилов В. Б., Гаврилова А. Р., Мажуль Л. М.) Принцип метода: тиобарбитуровая кислота реагирует с малоновым диальдегидом, который образуется при переокислении ненасыщенных жирных кислот, имеющих 2-3 диеновые связи, с образованием розового продукта, имеющего максимальное поглощение при 535 нм. Нормативные величины: 100-120 нмоль/л. Определение диеновых коньюгатов в плазме крови по УФ-поглощению гептановых и изопропанольных экстрактов (Гаврилов В. Б., Гаврилова А. Р., Хмара Н. Ф.) Принцип метода: метод основан на измерении интенсивности поглощения в области 223- 234 нм, обусловленной конъюгированными диеновыми структурами (предварительно экстрагированными из плазмы), возникающими при образовании гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот. Спектрофотометрическое определение содержания ацилгидроперекисей (диеновых конъюгатов) в плазме (сыворотке) крови. Принцип метода основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в крови по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра (233 нм). Витамины с антиоксидантными свойствами. Витамин А (ретинол) - жирорастворимый витамин, содержащийся в животных продуктах в форме А, и А2, в растениях в форме провитамина - каротина, наиболее активным среди которых является бета-каротин. Нормальная концентрация в сыворотке - 1,05-2,27 мкМ/л или 300-650 мкг/л. Недостаточность витамина А, которая может возникать не только при дефиците ретинола или каротина в пище, но и из-за нарушения их всасывания при заболеваниях кишечника, а также при малом количестве жира и белка в пище, способствует усилению ПОЛ. В большей степени страдает эпителий различных органов и глаза (замедление восстановления зрительного пурпура - родопсина). Это проявляется повышенной восприимчивостью к бронхолегочным заболеваниям, инфекциям мочевыводящих путей, слизистой оболочки глаз, кожи, снижением остроты зрения в темноте («куриная слепота»). Витамин Е (токоферолы) - группа веществ, среди которых наибольшей активностью обладает альфа-токоферол. Жирорастворимый витамин, действует сопряженно с витамином А. В сыворотке крови и клетках основная часть связана с липопротеидами. Определение уровня альфа-токоферола в плазме крови. Принцип метода: Альфа-токоферол плазмы экстрагируют смесью «этанол-гексан». Отобранную гексановую фазу выпаривают. К полученному остатку добавляют хлорное железо, способное восстанавливаться из трехвалентного состояния в двухвалентное под действием антиоксидантов (и прежде всего альфа-токоферола). О количестве альфа-токоферола судят по содержанию восстановленного железа, которое определяют реакцией с альфа-2-,альфа-2-дипиридилом, сопровождающейся образованием комплекса красного цвета. Нормальная концентрация в сыворотке крови - 5-20 мг/л. Степень обеспеченности организма витамином Е можно характеризовать путем непосредственного определения его концентрации в крови, и косвенным методом, определяя перекисную резистентность эритроцитов . Перекисная резистентность эритроцитов (ПРЭ) - показатель обеспеченности мембран антиоксидантами, в первую очередь витамином Е, и их устойчивости к повреждающему действию перекисей. Нормальная величина - до 10%. Увеличение свидетельствует о недостаточной антиоксидантной защите клеточных мембран, высокой подверженности ПОЛ и лабильности. Имеются сезонные колебания ПРЭ с повышением процента перекисного гемолиза в весенний период. . Витамин С (аскорбиновая кислота) - водорастворимый витамин, который, в отличие от животных, в организме человека не синтезируется и поступает только с пищей. Предотвращает окисление витаминов А и Е, восстанавливает окисленные формы ферментов и различных субстратов участвует в большом количестве обменных реакций. Регулирует проницаемость сосудистой стенки, существенно усиливает устойчивость организма к инфекциям, необходим при образовании коллагена, заживлении ран и ожогов. Нормальная концентрация: в крови -6-20 мг/л, в моче -20-30 мг/сутки. Суточная потребность - 45-60 мг; существенно возрастает при физической и нервно-психической нагрузке, низкой и высокой температуре, облучении, курении (1 сигарета разрушает 25 мг витамина С), беременности и кормлении, хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта, приеме антибиотиков и сульфаниламидов. Аскорбиновую кислоту не рекомендуется принимать онкологическим больным в период лучевой и химиотерапии. Недостаточность витамина С в пище способствует усилению ПОЛ, нарушениям обмена многих веществ, функций нервной и эндокринной систем, снижению устойчивости к инфекциям и проявляется слабостью, повышенной утомляемостью, раздражительностью, болями в конечностях и другими неспецифическими симптомами. Длительный авитаминоз вызывает развитие цинги. Антиоксидантные ферменты. Супероксиддисмутаза (СОД) - фермент, катализирующий реакцию нейтрализации супероксидного радикала О2. Является основным ферментом внутриклеточной антирадикальной защиты. Нормальная активность в эритроцитах (метод восстановления НСТ) - 1,04 ± 0,05 усл. ед./мг гемоглобина. Абсолютные величины колеблются в зависимости от используемых реактивов. Наиболее доступной для анализа является эритроцитарная СОД, содержащая CuZn. Определение активности эритроцитарной СОД методом R. Fried. Принцип метода: метод основан на определении степени ингибирования под действием эритроцитарной СОД реакции восстановления нитросинего тетразолия супероксидными радикалами. Исследование активности СОД выполняют при комнатной температуре. Кровь должна быть взята с гепарином. Фермент может оставаться стабильным до 1 недели при хранении при температуре +4 С. Активность фермента выражают в условных единицах (усл. Ед.). 50% ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия по сравнению с контрольной пробой принято считать 1 усл. ед. Нормативные величины:1,04±0,3/мг гемоглобина. В начальный период усиленного образования свободных радикалов происходит повышение активности СОД для их нейтрализации. Если процесс радикалообразования продолжает усиливаться, то на определенном этапе происходит истощение компенсаторных резервов и активность СОД снижается ниже нормы, что свидетельствует о декомпенсации данного защитного механизма. Увеличение активности СОД наблюдается при отравлениях гашишем, четырёххлористым углеродом, амитриптилином, фосфорорганическими соединениями, уксусной кислотой, при септицемии, очаговом туберкулёзе, лейкозах, мышечной дистрофии Дюшена, муковисцидозе, талассемии, инфаркте миокарда, при психических заболеваниях. Увеличение активности СОД без соответствующей активации или отсутствии других антиоксидантных ферментов - каталазы (гипо-, акаталаземия), пероксидаз является неблагоприятным изменением для организма из-за накопления перекиси водорода - продукта супероксиддисмутазной реакции. Снижение активности СОД наблюдается при отравлении окисью углерода, соединениями свинца, кадмия, при септикопиемии, при ИБС, атеросклерозе сосудов головного мозга, при эпилепсии, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, с ретинопатиями, у беременных с поздним токсикозом (диагностический тест для определения внутриутробной гипоксии плода). Низкие показатели активности фермента следует рассматривать как неблагоприятный прогностический признак, указывающий на снижение неспецифической резистентности организма. Проводить определение активности СОД целесообразно с одновременным исследованием других компонентов АОЗ и показателей ПОЛ. Каталаза - фермент, осуществляющий разложение перекиси водорода до кислорода и воды. Максимальное количество содержится в эритроцитах. Обладает специфической антиоксидантной защитной функцией в отношении эндотелиальных клеток. Нормальная активность - 18,4 - 25,0 мкЕД/эритроцит. В начальную компенсаторную фазу радикалообразования происходит повышение активности фермента, в фазу декомпенсации - снижение. С возрастом активность фермента падает. Определение активности каталазы методом E. Beutler. Принцип метода: метод основан на определении скорости разложения перекиси водорода в мМ/мин спектрофотометрически при длинне волны 230. Для стабилизации гемолизата и разложения комплекса каталаза - перекись водорода добавляют этанол. Определения активности каталазы крови по методу Баха и Зубковой. Принцип метода: метод основан на определении количества перекиси водорода, которое разрушается ферментом за 30 минут. В опыте определяют количество неразрушенной перекиси водорода в ходе каталазной реакции, в контроле количество перекиси,взятой в пробу с ферментом, инактивированным кипячением. Перекись водорода оттитровывают пермаганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:
2KMnO + 5H2O2 + 4 H2 SO + 2 KMnSO + 8H2O +5O2
Разность между цифрами титрования контроля и опыта соответствует количеству разрушенной перекиси водорода под действием каталазы. Нормативные величины: Метод титрометрии: каталазное число 12-20. В одном мкл. Крови у мужчин содержится 4·10- 5·10 эритроцитов, у женщин 3,9·10 - 4,7·10 эритроцитов. Метод фотометрии: по E. Beutler 15,31·10 ± 2,39·10 МЕ/г гемеглобина. Увеличение активности каталазы наблюдается при гемолитических состояниях, при хирургических вмешательствах проводимых под местной анестезией, у детей с бронхолёгочной патологией, ревматойдным артритом, тиреотоксическим зобом. Снижение активности каталазы наблюдается при инфекционных заболеваниях, железодефицитной анемии, синдроме мальабсорбции, карциноме, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, хронических отравлениях фосфором, мышьяком, свинцом, ртутью, общем наркозе, назначении антибиотиков. Определение активности каталазы целесообразно проводить с одновременным исследованием активности других АО-ферментов, содержания метгемоглобина и продуктов ПОЛ. Наиболее распространенным методом определения активности ГР является спектрофотометрический метод. Среди других методов следует отметить колориметрическое определение активности ГР по скорости образования восстановленного глутатиона при йодометрическом титровании или с помощью цветной реакции с нитропрусидом. Определение активности ГР методом Бойтлера. Принцип метода: метод основан на спектрофотометрическом определении количества израсходованного в ходе ферментативной реакции кофермента НАДФН, учитываемого по изменению поглощения при 340 нм. Длинна волны 340 нм соответствует максимуму поглощения восстановленного кофермента. В ходе реакции по мере окисления НАДФН оптическая плотность инкубационной пробы снижается. Активность ГР значительно повышается в сыворотке больных саркомой, у больных карциномой молочной железы и при других неопластических заболеваниях. Увеличение ГР наблюдается при гепатитах, механической желтухе и реже - при циррозе. Высокие значения активности могут определяться при остром инфаркте миокарда. Как правило, мегалобластическая анемия сопровождается повышением уровня активности ГР. Глутатионпероксидаза (ГП). Катализирует реакцию окисления глутатиона Г- SH перекисью водорода (1-я реакция) или гидроперекисями ROOH (2-я реакция), образующийся в результате ПОЛ. Вклад ГП в обезвреживание перекиси водорода по сравнению с каталазой более значителен. Она имеет большее сродство к перекиси водорода и разлагает ее даже при небольших концентрациях. В активном центре фермента находится селен. На 1 моль фермента приходится 4 грамма атома селена.
Определение активности ГП методом E. Beutler. Принцип метода: метод основан на определении скорости образования окисленного глутатиона, содержание которого определяется в сопряженной глутатионредуктазной реакции по степени окисления НАДФН при 340нм.
Г - S - S - Г + НАДФН→2Г - SH + НАДФ В качестве гидроперекиси используют t-бутил гидропероксид. Нормативные величины: По Beutler 30,8± 4,73 МЕ/г гемоглобина (при заборе крови с ЭДТА) и 34,2±3,84 МЕ/г гемоглобина (в гепаринизированной крови). По Тицу: 19,9±0,31 МЕ/моль гемоглобина и 0,89±0,14 НЕД/эритроцит. Увеличение активности наблюдается при дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, α-талассемии, остром лимфоцитарном лейкозе.
Снижение активности ГП наблюдается при железодефицитной анемии, отравлении свинцом, серповидноклеточний анемии, дефиците селена. Церулоплазмин (медная оксидаза). Медьсодержащий гликопротеид α2-глобулиновой фракции. Функции цирулоплазмина разнообразны: это основная оксидаза плазмы крови, реактант острой фазы, осуществляет транспорт Cu для синтеза СОД и цитохромоксидазы. Цирулоплазмин проявляет свои АО свойства экстрацеллюлярно без образования каких бы то ни было радикалов.
Чистый белок церулоплазмина имеет интенсивную голубую окраску. Простой колориметрический метод, который предложил Ravin, широко используется в модификации (С.В. Бестужевой и В.Г. Колба). Существуют и другие методы исследования: нефелометрический, манометрический и иммунологический. При манометрическом методе реакция проходит в аппарате Варбурга, измеряют скорость потребления кислорода (мкмоль потребленного кислорода за 1 мин на 1 литр сыворотки в определённых условиях). Отмечена превосходная корреляция между значениями, полученными колориметрическим методом Ревина и монометрическим. Колориметрический метод модифицирован для использования в автоанализаторе. Определение активности цирулоплазмина модифицированным методом Ревина. Принцип метода: метод основан не ферментном окислении n-фенилендиамина церулоплазмином. Реакция останавливается добавлением фтористого Nа. По оптической плотности образующихся окрашенных продуктов судят о концентрации церулоплазмина. Уровень церулоплазмина в сыворотке увеличевается при различных инфекционных заболеваниях, при остром и хроническом воспалительных процессах, сопровождающихся деструктивными и некротическими изменениями в тканях, при злокачественном росте и шизофрении. Антиоксидантная активность (АОА) - комплекс ферментативных и неферментативных реакций связывания и разложения промежуточных продуктов пероксидации, тормозящих свободно-радикальное окисление липидов. Определяется чаще всего методом хемилюминисценции в модельных системах. Нормальная величина для сыворотки крови - 60-75%. Высокий уровень АОА обеспечивает устойчивость к перекисным повреждениям клеточных мембран и низкий уровень ПОЛ. Низкий уровень АОА способствует усилению ПОЛ, торможению процессов пролиферации и регенерации. Клиническое значение определения АОА состоит в той, что одни патологические процессы развиваются на фоне повышенной АОА, а другие - на фоне сниженной АОА и поэтому требуют разнонаправленной коррекции. . Заключение
Таким образом, в основе сохранения свободнорадикального гомеостаза лежит баланс между прооксидантными и антиоксидантными процессами, поддерживающими перекисное окисление в пределах, не только совместимых с жизнью, но и полезных для нее. Нарушение этого баланса является отправной точкой в инициации «свободнорадикальной патологии». Срыв антиоксидантной защиты характеризуется развитием свободнорадикальных повреждений разных компонентов клеток и тканей. Все клеточные компоненты в той или иной степени подвержены перекисному окислению, но наиболее выражен этот процесс в липидных (фосфолипидных) структурах, прежде всего в липидном бислое мембран. Нарушение про-, антиоксидантного равновесия, сопровождающееся увеличением концентрации продуктов ПОЛ в тканях и жидкостях организма, отмечено при самых различных заболеваниях: воспалительных, сердечнососудистых, онкологических, инфекционных, ожоговой и лучевой болезни, при разнообразных токсических воздействиях, а также при старении организма. Все это позволяет исследователям рассматривать активацию ПОЛ как универсальный компонент неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия, т.е. как звено стресс-реакции. Из изложенного выше следует, что механизм поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия достаточно сложен. С одной стороны, действуют окислительные и проокислительные факторы и субстраты: молекулярный кислород, ОН˙, гидроперекиси, органические перекиси, эпоксиды, легко-окисляющиеся субстраты (липиды), окислительные ферменты и свободные ионы металлов с переменной валентностью, нейромедиаторы (катехоламины). С другой, - антиоксидантные компоненты; ферменты (СОД, ГПО, глутатионтрансфераза, каталаза), гормоны (стероидные и тиреоидные), биоамины (серотонин, гистамин), жирорастворимые антиоксиданты - компоненты мембран (токоферолы, убихиноны, ретиноиды, каротиноиды, фенольные соединения); водорастворимые антиоксиданты (тиоловые соединения, аскорбат, водорастворимые фенолы); ионы селена - свободные и в составе антиоксидантных ферментов.
Для лабораторной диагностики выраженности окислительного стресса и определении показания для использования препаратов с антиоксидантными свойствами целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также интенсивности свободнорадикальных реакций (процессов ПОЛ) в организме пациента. В результате проведённого анализа литературы можно сделать вывод, что для оценки состояния интенсивности перекисного окисления липидов в организме человека необходимо использовать интегративные подходы, использование только одного из указанных выше тестов не дает полной информации. Также лабораторная диагностика интенсивности ПОЛ необходима для суждения об АО-активности того или иного препарата, так как на основании клинических признаков невозможно адекватно оценить деиствие АО-препарата.
Список использованных источников
Дубинина, Е. Е. Окислительный стресс как реакция адаптации организма к экстремальным условиям / Е. Е. Дубинина //Вопросы медицинской химии. - 2001. - № 6., том 47 - С. 561-581. Балаболкин, М. И. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета / М. И. Балаболкин, Е. М. Клебанова // Проблемы эндокринологии. - 2000. - № 6. - С. 29-34. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в главных системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова; под ред. А.И. Деев. - М.: ВИНИТИ, серия биофизика, 1991. - 252 с. Свободные радикалы. Определение, номенклатура, классификация [Электронный ресурс] / академик РАМН, профессор Владимиров Ю.А. - 2006. - Режим доступа: #"justify">Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Медицина, 1972. - 252 с. Шанин, Ю.Н. Антиоксидантная терапия в клинической практике / Ю.Н. Шанин, В. Ю Шанин, Е. В.Зиновьев. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2003 - 128 с. Зайчик, А.Ш. Общая патофизиология (с основами иммунологии) / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурило. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2005. - 656 с. Кашулина, А. П. Роль перекисного свободнорадикального окисления в патологии и методы его изучения / А. П. Кашулина, Е. Н. Сотникова // Мед. консультирование. - 1996. - № 2. - С. 20-24. Буеверов, А. О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени / А. О. Буеверов. // Российский журнал гастроэнторологии. - 2002. - № 4. - С. 21-25. Хуцишвили, М. Б. Свободнорадикальные прцессы и их роль в патогенезе некоторых заболеваний / М. Б. Хуцишвили, С. И. Рапопорт. // Клиническая медицина. - 2002. - № 10. - С. 10-16. Troy, C.M. Down-regulation of copper zinc superoxide dismutase causes apoptotic death in PC 12 neuronal cells / C.M. Troy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - № 14. - P. 6384 - 6387. Болдырев, А. А. Введение в биомембранологию: учеб. пособие / Под ред. А. А. Болдырева. - М.: Изд-во МГУ, 1997. - 208 с. Повреждение компонентов биологических мембран при патологических процессах [Электронный ресурс] / М.: - 2006. - Режим доступа: #"justify">Radi, R. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide / R. Radi // Arch. Biochem. Biophys. - 1991. - №2. - P. 481-487. Даниловой, Л. А. Сборник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л. А. Даниловой. - СПб.: Питер, 2003. - 736 с. Лифшиц, В.М. В. И. Сидельникова. ″Медицинские лабораторные анализы″. Справочник. Издание второе исправленное и дополненное / В.М. Лифшиц, В. И. Сидельникова.- М.: ″Триада - Х″, 2003. - 312 с. Николаев, А. Я. Биологическая химия / Николаев А. Я. - М.: Медицинское информационное агенство, 2001. - 496 с.Похожие работы на - Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов
Незначительная часть кислорода, поступающего из воздуха в организм, превращается в активные формы - свободные радикалы, обладающие высокой химической активностью, вызывающие окисление белков, липидов, нуклеиновых кислот. Чаще всего окислению подвергается липидный слой биологических мембран. Такое окисление называется перекисным окислением липидов (ПОЛ).
Физические нагрузки, свойственные современному спорту, приводят к чрезмерному образованию активных форм кислорода и значительному росту скорости ПОЛ. Практически любая спортивная работа протекает в условиях повышенного потребления кислорода, а перенасыщение организма (или отдельных органов, или тканей) кислородом способствует появлению свободных радикалов кислорода и интенсификации перекисных процессов. В ациклических видах спорта (особенно в спортивных играх и единоборствах) характер мышечной деятельности резко и многократно меняется. Такие изменения сопровождаются несоответствием между продолжающимся повышенным поступлением кислорода и снижением его потребления митохондриями мышечных клеток. Подобное несоответствие вызывает относительную гипероксию в мышечной ткани, что, несомненно, приводит к еще большему образованию свободных радикалов и дальнейшему нарастанию их повреждающего воздействия на биомембраны. К повышению скорости свободнорадикального окисления также приводит ацидоз (повышение кислотности), возникающий у спортсменов вследствие накопления в миоцитах молочной кислоты. И, наконец, приближающиеся к пределу функциональных возможностей физические нагрузки современного спорта, его высокая мотивированность и эмоциональность позволяют выявить в деятельности спортсменов многие характерные черты стресса. А стресс и, в частности, стрессорные гормоны оказывают значительное влияние на развитие в организме свободнорадикального окисления.
Чрезмерная активация ПОЛ оказывает негативное влияние на мышечную деятельность. Так, повышение проницаемости мембран нервных волокон и саркоплазматического ретикулума миоцитов, вызываемое ПОЛ, затрудняет передачу двигательных нервных импульсов и, тем самым, снижает сократительные возможности мышцы. Повреждающее воздействие перекисного окисления на цистерны, содержащие ионы кальция, неизбежно приводят к нарушению функции кальциевого насоса и ухудшению релаксационных свойств мышц. При повреждении митохондриальных мембран снижается эффективность окислительного фосфорилирования (тканевого дыхания), что ведет к уменьшению аэробного энергообеспечения мышечной работы. Повышение проницаемости оболочки мышечных клеток - сарколеммы - может привести к потере мышечными клетками многих важных веществ, которые будут уходить из них в кровь и лимфу. Таким образом, в масштабе всего организма активация ПОЛ сказывается на возможностях аэробного энергопроизводства, на сократительных способностях мышц и, следовательно, на работоспособности спортсмена в целом.
Все вышесказанное позволяет считать процессы свободнорадикального окисления, и, в первую очередь, липидов биологических мембран, важнейшим дезадаптационным фактором, обусловливающим развитие утомления и снижение физической работоспособности. В настоящее время для предупреждения утомления и сохранения физической работоспособности в спортивной практике применяются различные экзогенные средства, способные повышать емкость антиоксидантной системы организма. К ним прежде всего относится a-токоферол - естественный антиоксидант организма, ЛАТЛ, Эйферол.
Во время мышечной работы в организме возникают и нарастают разнообразные биохимические и функциональные сдвиги, приводящие, в конечном счете, к снижению физической работоспособности и развитию утомления. Устранение этих негативных изменений осуществляется после работы, в процессе восстановления.
Срочное восстановление:
На этом этапе устраняются продукты анаэробного обмена, главными из которых являются креатин и лактат.
Креатин образуется и накапливается в мышечных клетках во время физических нагрузок за счет креатинфосфатной реакции:
Креатинфосфат + АДФ - Креатин + АТФ
Эта реакция обратима. Во время отдыха она протекает в обратном направлении:
Креатин + АТФ(избыток) - Креатинфосфат + АДФ
Обязательным условием превращения креатина в креатифосфат является избыток АТФ, который создается в мышцах после работы, когда уже нет больших энергозатрат на мышечную деятельность. Источником АТФ при восстановлении является тканевое дыхание, протекающее с достаточно высокой скоростью и потребляющее значительное количество кислорода. В качестве окисляемых субстратов чаще используются жирные кислоты. На устранение креатина требуется не более 5 мин. В течение этого времени наблюдается повышенное потребление кислорода, называемое алактатным кислородным долгом.
Другой продукт анаэробного обмена - лактат - образуется и накапливается в результате функционирования гликолитического пути ресинтеза АТФ. Устранение молочной кислоты происходит преимущественно во внутренних органах, так как она легко выходит из мышечных клеток в кровяное русло. Лактат, поступающий из крови в миокард, подвергается аэробному окислению и превращается в конечные продукты СО 2 и Н 2 О. Такое окисление требует кислорода и сопровождается выделением энергии, которая используется для обеспечения работы сердечной мышцы.
Значительная часть лактата из крови попадает в печень и превращается в глюкозу (глюконеогенез). Синтез глюкозы из лактата требует энергии АТФ, источником которого служит тканевое дыхание. Другая часть лактата из крови поступает в почки. В почках, так же как и в миокарде, лактат может окисляться с участием кислорода до углекислого газа и воды, давая этому органу энергию. Часть лактата выводится с мочой. Для устранения избытка лактата обычно требуется не более 1,5-2 часов.
В этот период в организме восполняются запасы химических соединений и восстанавливаются внутриклеточные структуры, разрушенные или поврежденные во время мышечной работы. Основными биохимическими процессами, составляющими отставленное восстановление являются синтезы гликогена, жиров и белков.
Синтез гликогена протекает в мышцах и в печени, причем в первую очередь накапливается мышечный гликоген. Синтезируется гликоген, главным образом, из глюкозы, поступающей в организм с пищей. Предельное время восстановления в организме запасов гликогена - 24-36 часов. Синтез жиров осуществляется в жировой ткани. Вначале образуются глицерин и жирные кислоты, затем они соединяются в молекулу жира. Жир также образуется в стенке тонкой кишки путем ресинтеза из продуктов переваривания пищевого жира. С током лимфы, а затем крови ресинтезированный жир поступает в жировую ткань. Для восполнения запасов жира необходимо не более 36-48 часов. Синтез белков, в основном, идет в мышечной ткани. Часть аминокислот (незаменимых) обязательно должна поступать с пищей. Максимальное время синтеза белков 48-72 часа.
Отставленное восстановление также включает и восстановление (репарацию) поврежденных внутриклеточных структур. Это касается миофибрилл, митохондрий, различных клеточных мембран. По времени это самый длительный процесс - 72-96 часов.
Все биохимические процессы, составляющие отставленное восстановление, протекают с потреблением энергии, источником которой является АТФ, возникающий за счет тканевого дыхания. Поэтому для фазы отставленного восстановления характерно несколько повышенное потребление кислорода, но не такое выраженное, как при срочном восстановлении /24/.
Болит все тело, мало кто задумывается о таких понятиях, как перекисное окисление липидов и окислительный стресс. Это слова из области физиологии, а мы не хотим изучать физиологию, мы хотим худеть, приводить в тонус или наращивать мышцы и поменьше сталкиваться с негативными последствиями. Тем не менее, если понять, какие процессы происходят в организме, становится ясно, какие меры принимать, чтобы не было мучительно больно.
Механизмы окислительного стресса: почему так больно после тренировок?
Когда мы выполняем физическую работу, клеткам нужно больше энергии. Основной метод её получения для клеток – окисление глюкозы в присутствии кислорода. Под нагрузкой потребность в живительном газе возрастает, но тот объем, который может быть разнесен по телу, ограничен: количеством вдыхаемого воздуха, мощностью , её способностью перегнать определенное количество крови, состоянием кровеносных , которые могут быть повреждены или забиты (атеросклероз).
Во время интенсивной тренировки организм переживает состояние гипоксии – недостатка кислорода. Ферменты, участвующие в дыхательной цепи клетки, при понижении концентрации кислорода переводят его в так называемые активные формы (АФК) с неспаренным электроном, которые в широких массах известны как свободные радикалы в организме.
Эти атомы способны взаимодействовать с жирами (фосфолипидами) клеточной оболочки, как бы ударяя их тем самым электроном и, в свою, очередь, превращая в переокиси – еще один вид свободных радикалов. Те делятся электроном с соседями, и изменение структуры затрагивает все больше и больше молекул мембраны, перекидываясь и на соседние клетки. Это и есть перекисное окисление липидов и окислительный стресс – цепная реакция, нарушающая структуру клеточных оболочек.
Почему перекисное окисление липидов несет негативные последствия?
Самое неприятное с точки зрения физиологии спорта последствие перекисного окисления липидов – упомянутое нарушение мембран. Они становятся более проницаемыми, а это порождает:
- Отток питательных веществ из клеток, а значит, поврежденные мышечные волокна лишатся стройматериала для своего ремонта. В местах концентрации возникают воспалительные реакции, сопровождающиеся концентрацией жидкости, а следовательно, сдавливанием нервных окончаний и болью. Кроме того, в целом замедляется после тренировки.
- Затруднение передачи нервных импульсов (большую роль в этом играет кальций, а его концентрации в клетке и вне её нарушаются), а с ними – сократимость мышцы. Нарушается нейромышечная связь, способность развивать максимальное усилие, что снижает спортивные результаты.
- Повреждение мембран не только клеток, но и их внутренних органелл, в том числе, митохондрий – энергетических субстанций клетки. Они могут усвоить меньше кислорода, что ведет к усугублению гипоксии и нарастанию процессов ПОЛ.
Как победить свободные радикалы в организме?
Чтобы предотвратить избыточное перекисное окисление липидов (в норме оно дает материал для синтеза простагландинов и тромбоксанов), необходимо:
- нейтрализовать образующиеся свободные радикалы в организме,
- увеличивать максимально возможный перенос кислорода, чтобы избежать гипоксии.
С первой задачей справляются антиоксиданты, например, один из самых мощных – . Вторая – комплексная, но для достижения каждой из тех целей, что она подразумевает, существуют натуральные средства:
- для укрепления сердечной мышцы и перекачки наибольшего количества крови – ;
- для увеличения количества гемоглобина в крови и переноса наибольшего количества кислорода – ;
- для защиты мелких кровеносных сосудов от повреждений – ;
- для прочищения сосудов от холестерина, очищения крови – , .
Кислород, будучи бирадикалом, энергично взаимодействует с органическими радикалами, имеющими неспаренный электрон. Эта реакция играет важную роль в живых организмах для продолжения и развития цепных радикальных процессов перекисного окисления липидов. Реакции ПОЛ протекают, главным образом, в липидном бислое клеточных мембран.
Процесс ПОЛ условно подразделяют на четыре стадии: инициирования цепей окисления, развитие цепных реакций, обрыв цепей, разрушение структуры окисленных липидов. Стадия инициирования свободнорадикального окисления липидов биомембран в качестве основных событий представлена разрушением связи углерод-водород, отрывом атома водорода от жирнокислотной цепи и его присоединением к свободному радикалу-прооксиданту, появлением углерод-центрированного липидного радикала.
Ключевой характеристикой радикалов, необходимой для начала цепной реакции, является окислительно-восстановительный потенциал (E ox / red). Так, в качестве прооксидантов для начала ПОЛ могут является любые радикалы, чей E ox / red больше чем у липидов.
1. Стадия инициирования.
Наиболее подвержены действию активных форм кислорода жирные кислоты, содержащие изолированные двойные связи, расположенные через СН 2 -группу. Именно от этой СН 2 -группы свободный радикал (Х‧) (инициатор окисления) легко отнимает электрон, превращая липид, содержащий эту кислоту, в свободный радикал:
─ СН2 ─ СН = СН ─ СН2 ─ СН = СН ─ СН2 ─
фрагмент остатка ненасыщенной жирной кислоты
+Х ∙↓ - ХН
─СН2 ─ СН= СН ─ СН ─ СН = СН ─ СН2 ─
радикальный центр
Единственный инициирующий свободный радикал способен образовать в липидной мембране посредством цепной реакции множество липидных пероксидов.
2. Стадия развития цепных реакций.
Молекулы с двумя конъюгированными двойными связями называются диеновые коньюгаты . После взаимодействия с молекулярным кислородом образуется липопероксирадикал LОО∙, а затем диеновые конъюгаты, после чего - пероксид липида LООН:
свободнорадикальный промежуточный продукт
+LН ↓ −L∙
─ СН2 ─ СН ─ СН = СН ─ СН = СН ─ СН2 ─
диеновый конъюгат
Диеновые конъюгаты и гидроперекиси можно рассматривать как первичные продукты ПОЛ.
3. Разрушение структуры липидов.
Дальнейшее окисление липидов приводит к образованию широкого спектра конечных продуктов ПОЛ: альдегидных и спиртовых производных с укороченной цепью, низкомолекулярных продуктов, эпоксидов,гидропероксида кислоты и малонового диальдегида.
4. Обрыв цепи.
Развитие цепи может останавливаться при взаимодействии свободных радикалов между собой:
или при взаимодействии с различными антиоксидантами, например, витамином Е, который отдаёт электроны, превращаясь при этом в стабильную окисленную форму:
LOO + L → LOOH + LH
L + vit E → LH + vit E
vit E + L → LH + vit Еокисл.
Результатом перекисного окисления липидов является снижение текучести мембран, облегчение перехода молекул фосфолипидов из одного монослоя мембран в другой, увеличение проницаемости мембран для различных субстанций (K + , Ca 2+ и т. д.), ковалентная модификация и изменение функциональной активности мембранных протеинов, рецепторов, энзимов и ионных каналов. Некоторые из продуктов перекисного окисления полиеновых жирных кислот оказывают выраженное цитотоксическое действие. Так 4-гидрокси-2-транс-ноненаль, обладая способностью ковалентно взаимодействовать с протеинами и ДНК, ингибирует специфическую активность различных ферментов, ионных каналов, рецепторов и индуцирует мутагенные эффекты. Возрастание уровня внутриклеточного Са 2+ в условиях оксидативного стресса сопровождается увеличением активности фосфолипазы А2 и, как следствие, высвобождением арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов. Арахидоновая кислота может как подвергаться свободнорадикальному окислению, так и использоваться в качестве субстрата в процессе синтеза эйкозаноидов. Синтез простагландинов тесно связан с перекисным окислением липидов не только из-за возрастания доступности арахидоновой кислоты, но и по причине стимуляции активности циклооксигеназ (ЦОГ) под влиянием липидных пероксидов.
Биохимия обмена веществ
Тема: Перекисное окисление липидов в норме и патологии. Ферментативное звено антиоксидантной системы защиты.
I Научно-методическое обоснование темы:
Активные формы кислорода – классификация и свойства.
А так же пергидроксильный (НО2∙), пероксильный (RO2∙) и алкоксильный (RO∙) радикалы, оксид азота (NO∙), пероксинитрит (ONOO-), гипохлорит (HOCl), перекись водорода (H2O2) и др. Помимо продуктов восстановления О2, к АФК относят также озон (О3) и синглетный кислород 1О2, то есть кислород, находящийся в возбужденном (синглетном) состоянии [Владимиров, 1998; Осипов, Азизова, Владимиров, 2003].
Активные формы кислорода образуются во многих клетках в результате последовательного одноэлектронного присоединения 4 электронов к 1 молекуле кислорода. Конечный продукт этих реакций - вода , но по ходу реакций образуются химически активные формы кислорода. Наиболее активен гидроксильный радикал, взаимодействующий с большинством органических молекул. Он отнимает от них электрон и инициирует таким образом цепные реакции окисления. Эти свободнорадикальные реакции окисления могут выполнять полезные функции, например, когда клетки белой крови с участием активных форм кислорода разрушают фагоцитированные клетки бактерий. Но в остальных клетках свободнорадикальное окисление приводит к разрушению органических молекул, в первую очередь липидов, и, соответственно, мембранных структур клеток, что часто заканчивается их гибелью. Поэтому в организме функционирует эффективная система ингибирования перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Источники активных форм кислорода
ЦПЭ как источник активных форм кислорода
Утечка электронов из ЦПЭ и непосредственное их взаимодействие с кислородом - основной путь образования активных форм кислорода в большинстве клеток.
Кофермент Q в ЦПЭ принимает от доноров последовательно по одному электрону, превращаясь в форму семихинона (рис. 8-55) - KoQH (см. раздел 6).
Этот радикал может непосредственно взаимодействовать с кислородом, образуя супероксидный анион , который, в свою очередь, может превращаться в другие активные формы кислорода:
Рис. 1. Реакции последовательного восстановления убихинона вдыхательной цепи.
Многие оксидазы - ферменты, непосредственно восстанавливающие кислород, образуют пероксид водорода - Н 2 О 2 . Оксидазы образуют пероксид водорода по схеме:
О 2 + SH 2 → S + Н 2 О 2 ,
где SH 2 - окисляемый субстрат.
Примеры таких оксидаз - оксидазы аминокислот, супероксид дисмугаза, оксидазы, локализованные в пероксисомах. Оксидазы пероксидом окисляют, в частности, жирные кислоты с очень длинной углеродной цепью (более 20 углеродных атомов) до более коротких, которые далее подвергаются β-окислению в митохондриях.
Монооксигеназы, например цитохром Р 450 , включающий один атом кислорода в окисляемую молекулу, и диоксигеназы, включающие оба атома кислорода, также служат источниками активных форм кислорода.
Пероксид водорода химически не очень активен, но способствует образованию наиболее токсичной формы кислорода - гидроксильного радикала (ОН ) по следующей реакции:
Fe 2+ + Н 2 О 2 → Fe 3+ + ОН - + ОН .
Наличие в клетках Fe 2+ или ионов других переходных металлов увеличивает скорость образования гидроксильных радикалов и других активных форм кислорода. Например, в эритроцитах окисление иона железа гемоглобина способствует образованию супероксидного аниона.
Супероксидный анион-радикал (О 2 -). Среди кислородных свободных радикалов ему отводят наиболее значительную роль, так как считается, что именно он является родоначальником многих других активных форм кислорода. Супероксидный радикал (СОР) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии . Химическая активность О 2 - в значительной степени зависит от физико-химического состояния окружающей его клеточной или внеклеточной среды. В водных растворах О 2 - способен окислять аскорбиновую кислоту, адреналин и тиоловые соединения , выступая как слабый окислитель [Хавинсон, Баринов, Арутюнян 2003]. Значительно более выражены восстановительные свойства супероксидного радикала. В присутствии ионов негемового железа СОР достаточно активно восстанавливает его из 3+ в 2+. Это свойство СОР чрезвычайно важно, поскольку двухвалентное железо играет большую роль в образовании агрессивных липидных и гидроксильных радикалов. Супероксидный радикал также может восстанавливать содержащие трехвалентное железо комплексы (цитохром с, ферри-ЭДТА) и нитросиний тетразолий.
Супероксиданион-радикал – пусковое звено каскада радикальных реакций, приводящих к возникновению большинства АФК и продуктов перекисного окисления липидов. Он участвует в синтезе хемотаксических пептидов, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует действие эндотелиального фактора расслабления, может повреждать мембраны эритроцитов, ингибировать Са-АТФазу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, окислять белки сыворотки, в тоже время его непосредственная цитотоксичность невелика.
Перекисное окисление липидов
Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются свободнорадикальными и постоянно происходят в организме. Свободнора-дикальное окисление нарушает структуру многих молекул. В белках окисляются некоторые аминокислоты. В результате разрушается структура белков, между ними образуются ковалент-ные "сшивки", всё это активирует протеолитические ферменты в клетке, гидролизующие повреждённые белки. Активные формы кислорода легко нарушают и структуру ДНК. Неспецифическое связывание Fe 2+ молекулой ДНК облегчает образование гидроксильных радикалов, которые разрушают структуру азотистых оснований. Но наиболее подвержены действию активных форм кислорода жирные кислоты, содержащие двойные связи, расположенные через СН 2 -группу. Именно от этой СН 2 -группы свободный радикал (инициатор окисления) легко отнимает электрон, превращая липид, содержащий эту кислоту, в свободный радикал.
ПОЛ - цепные реакции, обеспечивающие расширенное воспроизводство свободных радикалов, частиц, имеющих неспаренный электрон , которые инициируют дальнейшее распространение перекисного окисления.
Стадии перекисного окисления липидов
1) Инициация: образование свободного радикала (L )
Инициирует реакцию чаще всего гидроксильный радикал, отнимающий водород от СН 2 -групп полиеновой кислоты, что приводит к образованию липидного радикала.
2) Развитие цепи:
L + О 2 → LOO
LOO + LH → LOOM + LR
Развитие цепи происходит при присоединении О 2 , в результате чего образуется липопе-роксирадикал LOO или пероксид липида LOOH.
ПОЛ представляет собой свободнорадикальные цепные реакции, т.е. каждый образовавшийся радикал инициирует образование нескольких других.
3) Разрушение структуры липидов
Конечные продукты перекисного окисления полиеновых кислот - малоновый диальдегид и гидропероксид кислоты.
4) Обрыв цепи - взаимодействие радикалов между собой:
LOO + L → LOOH + LH, L + vit E → LH + vit E
vit E + L → LH + vit Е окисл.
Развитие цепи может останавливаться при взаимодействии свободных радикалов между собой или при взаимодействии с различными антиоксидантами, например, витамином Е, который отдаёт электроны, превращаясь при этом в стабильную окисленную форму.
3. Антиоксидантная система (АОС).
Образование АФК, известных как прооксиданты, наблюдается во многих метаболических процессах и является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток, а так же организма в целом, в кислородсодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляют ферментативные и неферментативные антиоксиданты. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса.
Классификация АОС системы:
А.Специфическая АОС:
Специализированные ферментные системы:
Супероксиддисмутаза (СОД);
Каталаза (КАТ);
Глутатионпероксидаза и глутатион трансфераза (ГПО и ГТ)
Специализированные неферментные системы:
Жирорастворимые антиоксиданты (АО): витамины Е,А,К; стероидные гормоны; влавоноиды; полифенолы (витамин Р, убихинон).
Аскорбатная АО-система;
Тиолдисульфидна система на основе глутатиона;
Ароматические соединения.
Основными функциями специфической АОС являются:
ограничение интенсивности реакции свободнорадикального и перекисного окисления, т.е. разрушение, образующихся АФК и продуктов их дальнейших превращений;
защита чувствительных к окислительным повреждениям биомолекул мембран, внутри - и внеклеточных структур от действия свободных радикалов и перекисных соединений;
восстановление окислительных молекулярных повреждений. В целом основная задача системы антиоксидантной защиты состоит в предотвращении и ограничении развития патологических состояний, вызываемых окислительными повреждениями структур организма.
Функция: предотвратить условия в процессе аутоокисленисубстратов (микросомальное окисление).
Ферментативное звено АОС
СОД - это ключевой водорастворимый фермент. Превращает супероксидные анионы в пероксид водорода: 2 + 2H + → H 2 O 2 + O 2 интка, железа и имидазол гистидина. Локализуется в цитоплазме. Обладает высокой термоустойчивостью, устойчив к действию протеаз, обладает широким оптимумом рН каталитической активности.
Изоферменты СОД находятся и в цитозоле и в митохондриях и являются как бы первой линией защиты, потому что супероксидный анион образуется обычно первым из активных форм кислорода при утечке электронов из дыхательной цепи.
СОД - индуцируемый фермент, т.е. синтез его увеличивается, если в клетках активируется перекисное окисление. Пероксид водорода, который может инициировать образование самой активной формы ОН , разрушается ферментом каталазой: 2Н 2 О 2 → 2 Н 2 О + О 2 .
Каталаза (КАТ) находится в основном в пероксисомах, где образуется наибольшее количество пероксида водорода, а также в лейкоцитах, где она защищает клетки от последствий "респираторного взрыва".
КАТ обеспечивает расщепление перекисси водорода до двух молекул воды и кислорода. Из-за большго молекулярного веса практичеки не проникает через мембрану клетки.
| Рис.2. Антиоксиданты водной фазы |
Глутатионпероксидаза (ГПО) - важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию АФК, так как он разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин). Сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу.
Н 2 О 2 + 2 GSH → 2 Н 2 О + G-S-S-G.
Окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой:
GS-SG + NADPH + Н + → 2 GSH + NADP + .
Глутатионпероксидаза, которая восстанавливает гидропероксиды липидов в составе мембран, в качестве кофермента использует селен (необходимый микроэлемент пищи). При его недостатке активность антиоксидантной защиты снижается.
ГПО является главной ферментативной системой плазмы крови: внеклеточных жидкостей и гидроперекисей липидов (ГПО 4), которая будучи липофильным соединением эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфотидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах низкой плотности (ЛПНП), восстанавливая их, следовательно, защищая от окислительной модификации. Кроме того ГПО 4 совместно с токоферолом практически полностью подавляет ПОЛ в биологических мембранах благодаря тому, что витамин Е эффективно восстанавливает пероксирадикалы, а фермент разлагает гидроперекиси, препятствуя тем самым их вовлечению в окислительный цикл.
Глутатионтрансфераза (ГТ)
ГТ, в отличие от селенсодержащей ГПО, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидроперекиси с малым размером молекул, эффективно восстанавливает гидрофобные гидроперекиси с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот (линолевой и арахидоновой), фосфолипидов.
Вместе с тем во всех водных и липидных фазах организма могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют антиоксиданты-ингибиторы органических радикалов, среди которых важное место занимают соединения фенольного типа.
В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений , среди которых выраженным антиоксидантным эффектом обладают витамины Е и К, убихиноны, триптофан и фенилаланин, а так же большинство растительных (флавоноиды) и животных пигментов.
Неферментативнгое звено АОС
Витамин Е (α-токоферол) - наиболее распространённый антиоксидант в природе - является липофильной молекулой, способной инактивировать свободные радикалы непосредственно в гидрофобном слое мембран и таким образом предотвращать развитие цепи перекисного окисления. Различают 8 типов токоферолов, но α-токоферол наиболее активен.
Витамин Е отдаёт атом водорода свободному радикалу пероксида липида (ROO ), восстанавливая его до гидропероксида (ROOH) и таким образом останавливает развитие ПО. Свободный радикал витамина Е, образовавшийся в результате реакции, стабилен и не способен участвовать в развитии цепи. Наоборот, радикал витамина Е непосредственно взаимодействует с радикалами липидных перекисей, восстанавливая их, а сам превращается в стабильную окисленную форму -- токоферолхинон.
В антирадикальной защите липопротеинов плазмы крови и клеточных мембран α-токоферолу принадлежит ведущая роль – одна его молекула защищает ≈10000 молекул ненасыщенных жирных кислот, при этом считается, что α-токоферол способен обезвредить не менее 60% образующихся пероксильных радикалов. Окисление α-токоферола со свободными радикалами компенсируется биорегенерацией молекул этого антиоксиданта в реакциях восстановления коантиоксидантами (АН), редокс-потенциал которых ниже, чем у радикала α-токоферола (α-Тф-О.). В результате такой реакции не только происходит восстановление витамина Е, но и предотвращается возможность инициации α-токофероксильным радикалом окисления липидов:
α-Тф-О. + RH→ α-Тф-ОH + R. (1)
α-Тф-О. + АH→ α-Тф-ОH + А. (2)
В физиологических условиях вторая реакция обычно превалирует над первой, так как константа скорости реакции α-Тф-О. с НЖК не превышает 103М-1с-1, в то время как для реакции (1) константа скорости может достигать значений 104-107М-1с-1.К наиболее изученным коантиоксидантам относятся убихинол, аскорбиновая кислота (АК), билирубин.
Витамин Е (а-токоферол) ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона, что приводит к инактивации радикала липида, а витамин Е превращается в стабильный, полностью окисленный токоферолхинон.
Рис. 3. Механизм антиоксидантного действия витамина Е.
Рис.4. Окислительно-восстановителные превращения α-токоферола и сопряженных с ним коантиоксидантов.
Витамин С (Рис.5.) (аскорбиновая кислота) также является антиоксидантом и участвует с помощью двух различных механизмов в ингибировании ПОЛ. Во-первых, витамин С восстанавливает окисленную форму витамина Е и таким образом поддерживает необходимую концентрацию этого антиоксиданта непосредственно в мембранах клеток. Во-вторых, витамин С, будучи водорастворимым витамином и сильным восстановителем, взаимодействует с водорастворимыми активными формами кислорода - , Н 2 О 2 , ОН и инактивирует их.
β-Каротин,
предшественник витамина А (рис.6.), также обладает антиоксидантаьш действием и ингибирует ПОЛ. Показано, что растительная диета, обогащённая витаминами Е, С, кароти-ноидами, существенно уменьшает риск развития атеросклероза и заболеваний ССС, подавляет развитие катаракты - помутнения хрусталика глаза, обладает антиканцерогенным действием. Имеется много доказательств в пользу того, что положительное действие этих компонентов пищи связано с ингибированием ПОЛ и других молекул и, следовательно, с поддержанием нормальной структуры компонентов клеток.
Рис.5. Витамин С.
Рис. 6. Витамин А
АК превосходит другие антиоксиданты плазмы в защите липидов от перекисного окисления, так как только это соединение достаточно реакционноспособно, чтобы эффективно ингибировать инициацию ПОЛ в водной фазе.
Важными внеклеточными антиокислителями являются альбумины – простые гидрофильные белки плазмы крови, которые являются основными носителями SН групп. SН содержащим соединениям принадлежит ведущая роль в защите клеток от ОН-радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате разложения молекул воды под действием ионизирующих излучений.
Необходимо отметить Коллоидные">наличие антирадикальных свойств у белков , хелатирующих ионы железа и других металлов с переменой валентностью. В первую очередь это трансферрин, лактоферрин и церулоплазмин. Основная роль трансферрина и близкого ему по структуре лактоферрина, содержащегося в молоке и выделяющегося фагоцитами при их активации, состоит в акцептировании «свободного» железа, что препятствует образованию радикалов НО, в реакциях Фентона, катализируемых ионами Fe. Значимую роль в этом процессе играет церулоплазмин, Cu-содержащий белок, обеспечивающий окисление Fe 2+ до Fe3+ и делающий тем самым железо доступным для связывания трансферрина.
Наиважнейшим антиоксидантом внеклеточной жидкости является мочевая кислота (МК). Ввиду высокого ее содержания в плазме крови человека некоторые исследователи считают, что на нее приходится 35-65% защиты липопротеинов от окисления, 10-15% ингибирования НО. и 12% ингибирования синглетного кислорода. Кроме того МК может выступать синергистом с радикалами α-токоферола и аскорбиновой кислотой, что усиливает их антиоксидантное действие.
В последние годы широко обсуждается роль активных форм кислорода (АФК) и инициируемых ими свободнорадикальных процессов при различных патологических процессах. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях происходит усиленное образование АФК, под действием которых происходит избыточная и неконтролируемая активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что в конечном итоге может привести к патологическому состоянию, которое сопровождается дисбалансом ферментативных и неферментативных компонентов системы антиоксидантной защиты. Характерным проявлением окислительного стресса является интенсификация процессов перекисного окисления липидов, индикатором которой служит увеличение содержания хотя бы одного из его продуктов. Данные о содержании продуктов ПОЛ в биологических объектах могут нести в себе информацию о глубине и степени патологического процесса. В качестве количественных маркеров наиболее часто используются такие интермедиаты ПОЛ, как диеновые конъюгаты (ДК), а также один из его конечных продуктов – малоновый диальдегид (МДА).
II Цель деятельности студентов на занятии
Студент должен знать:
АФК. Каким действием они обладают;
Источники образования АФК;
ПОЛ в норме;
ПОЛ при патологии;
Стадии ПОЛ;
АОС, классификация, функции;
Ферментативное звено АОС;
Описать действие СОД, характеристики;
КАТ. Механизм действия;
ГПО и ГП. Механизм действия;
Неферментативное звено АОС;
«Окислительный стресс»;
Уметь писать реакцию, катализируемую СОД;
Уметь писать реакцию, катализируемую КАТ;
Уметь писать реакцию, катализируемую ГПО;
Написать стадии ПОЛ;
Основные вопросы:
АФК. Механизм действия;
Источники АФК в организме;
ПОЛ в норме;
Особенности ПОЛ в условиях патологии;
Стадии ПОЛ;
АОС, классификация, функции;
Ферментативное звено АОС;
Характеристики СОД. Механизм действия;
КАТ. Механизм действия;
ГПО и ГП. Механизм действия;
Неферментативное звено АОС;
Роль витамина Е в стрессовой ситуации.
Роль витамина А,К в защите клеток от действия АФК;
Роль ионов меди, цинка, железа и других металлов в АОС;
«Окислительный стресс».
Наглядные пособия:
Рисунки: 1. Реакции последовательного восстановления убихинона вдыхательной цепи; 2. Антиоксиданты водной фазы; 3. Механизм антиоксидантного действия витамина Е; 4. Окислительно-восстановителные превращения α-токоферола и сопряженных с ним коантиоксидантов ; 5. Витамин С, 6. Витамин А; 7. Повреждающее действие свободных радикалов на компоненты клетки ; 8. Образование супероксида в ЦПЭ ,
V Наименование лабораторной работы:
VI Перечень вопросов для проверки исходного уровня знаний:
ЛАБОРАТОНАЯ РАБОТА №1
Количественное определение малонового диальдегида в ткани печени.
ОБОРУДОВАНИЕ: баня, ФЭК.ПРИНЦИП МЕТОДА.
Основан на определении малонового диальдегида (МДА) как показателя перекисного окисления липидов при инкубации гомогенатов тканей в присутствии кислорода. В присутствии прооксидантов МДА определяется по специфической цветной реакции в кислой среде с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).
ХОД РАБОТЫ.
В трех центрифужных пробирках приготовить инкубационную смесь реактивов по следующей схеме:
Реактивы | 1 пробирка “опытная” | 2 пробирка “контроль” | 3 пробирка “опытная” с добавлением про- оксидантов |
Трис-буфер 0,15 М | 3,4 мл | 3,4 мл | 1,4 мл |
Сульфат железа FeSO 4 | - | - | 1 мл |
Аскорбиновая кислота | - | - | 1 мл |
ТХУ 10% раствор с ЭДТА | - | 1 мл | - |
Гомогенат печени | 1,0 мл | 1,0 мл | 1,0 мл |
Все пробирки поместить в термостат при 37 о С на 15 минут. После инкубации остановить реакцию в 1 и 3 пробирках, добавляя в них по 1 мл ТХУ с ЭДТА, перемешать. Все пробирки центрифугировать в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить в чистые пробирки. Затем в другие чистые пробирки отобрать по 4 мл надосадочной жидкости, добавить по 2 мл свежеприготовленного раствора ТБК (тиобарбитуровая кислота) и поместить пробирки в кипящую баню на 15 минут. Пробирки охладить в холодной воде и определить оптическую плотность на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм) в кювете 10 мм.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Активность ПОЛ выражается количеством микромолей МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената
, где
Х - количество МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената,
a - молярный коэффициент экстинкции для малонового диальдегида при реакции с ТБК, численно равный 0.156.
D оп и D конт - оптические плотности "опытной" и "контрольной" пробирок соответственно.
РАСЧЕТ И ВЫВОДЫ:
ЛАБОРАТОНАЯ РАБОТА №2
Количественное определение каталазы в крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
В основе количественного определения активности каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени. О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества перманганата калия. израсходованного на титрование перекиси водорода до и после действия каталазы.
Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое разлагается под действием 1 мкл крови.
ХОД РАБОТЫ.
Работу проводят по следующей схеме:
Р е а к т и в ы | Стаканчик № 1 (опыт) | Стаканчик № 2 (контроль) |
Кровь | 1 мл | 1 мл |
Вода дистиллированная | 7 мл | 7 мл |
Перекись водорода 1% | 2 мл | - |
Серная кислота 10% | - | 5 мл |
Стаканчики оставляют на 30 мин при комн. t°, изредка встряхивая Через 30 мин |
||
Перекись водорода 1% | - | 2 мл |
Серная кислота 10 % | 5 мл | - |
Действие каталазы в кислой среде прекращается, т. к. этот фермент действует при рН=7,4. Поскольку в контрольную пробу серную кислоту приливали до добавления перекиси водорода, то в контроле все добавленное количество перекиси водорода остается нерасщепленным.
Содержимое каждого стаканчика необходимо титровать раствором перманганата калия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.
КЧ = (А - В) х 1,7 ,
А - кол-во 0,1 N раствора КМnО 4 , пошедшее на титрование контрольной пробы в мл.
В - кол-во 0,1N раствора КМnО 4 , пошедшее на титрование опытной пробы в мл.
1,7 - это коэффициент, показывающий, сколько мг Н 2 О 2 содержится в 1мл 0,1н. раствора Н 2 О 2 .
В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц у взрослых и 7,5 - 9,9 единиц у детей.
РАСЧЕТ И ВЫВОДЫ:
Самостоятельная работа: составление тестов и кроссворда по теме ПОЛ.
Тестовый контроль:
Тема: ПОЛ.
1. К активным формам кислорода относят:
1. ОН- - гидроксильный радикал;
2. супероксидный анион;
3. Н2О2 - пероксид водорода
4. все перечисленное
Отв.: 4
2. Образование активных форм кислорода происходит:
в процессе переноса электронов в митохондриальной дыхательной цепи;
в реакциях, которые катализируются оксидазами (образуется перекись водорода), в том числе в свободнорадикальных процессах, совершающихся в фагоцитах;
в реакциях микросомального окисления при обезвреживании веществ с участием цитохрома Р-450;
в реакциях самопроизвольного (неферментативного) окисления веществ (гемоглобина, ферредоксинов, адреналина и др.);
в биологических системах с наличием ионов металлов с переменной валентностью и, прежде всего, железа (свободных атомов, так называемых внегемовых);
верно все
3. Перечислите ряд причин вызывающих активацию ПОЛ в тканях:
снижение поступления в организм алиментарных антиоксидантов (АО), таких как: токоферол, аскорбат, биофлавоноиды и др.;
стресс различного генеза, в частности эмоциональный (под влиянием катехоламинов и кортикостероидов в кровь поступает избыток жирных кислот и кислород);
внешние химические прооксиданты (пестициды, лекарственные окислители, алкоголь, продукты смога и т.д.);
физические факторы (повышенный радиоактивный фон, ультрафиолетовое облучение, электромагнитное поле, ультразвук с интенсивностью выше 2 Вт/см);
избыточное и несбалансированное потребление жиров и углеводов на фоне недостаточного их расходования;
гипокинезия с низким уровнем биологического окисления ферментов, т.е. сниженный уровень восстановления пиридиннуклеотидов;
врожденные энзимопатии антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы);
падение с возрастом активности антиоксидантных ферментов.
верного ответа нет
верно все перечисленное
4. Антиоксиданты нужны для…, исключите неправильный ответ:
обновления липидного состава мембран;
синтеза эйкозаноидов
обезвреживания ксенобиотиков и токсичных продуктов метаболизма;
функционирования иммунной системы.
синтеза глюкогона
5. Оксидативный стресс приводит:
Повреждение ДНК, белков, липидов мембран.
Канцерогенез, нейродегенеративные болезни, атеросклероз, сахарный диабет, сердечно сосудистые заболевания , старение.
6. Этот витамин ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона, что приводит к инактивации радикала липида и превращается в стабильный, полностью окисленный токоферолхинон: Отв.: 3
7. Вит. A:
увеличивает антиоксидантное действие Вит. Е; Вместе с Вит. E и Вит. С;
активирует включение Se в состав глутатионпероксидазы;
препятствует окислению SH-групп белков и пептидов.
может быть прооксидантом
все верно
Структура, какого витамина представлена ниже :
|
Отв.: 1
9. Этот витамин активирует ПОЛ так как является полиненасыщенным спиртом и легко окисляется кислородом может быть прооксидантом (в высоких дозах):
Отв.: 210. Процесс свободнорадикального перекисного окисления липидов можно условно разделить на три этапа. Перечислите их в правильной последовательности.
продукция перекисей липидов (перекисный этап);
образование свободных радикалов органических и неорганических веществ (свободнорадикальный этап);
кислородная инициация (кислородный этап
VIII Хронокарта учебного занятия:
Общий бюджет времени: 3 (125);
Перекличка 5 минут;
Разбор основных вопросов темы 60 минут;
Тестовый опрос 20 минут;
Проведение лабораторной работы;
Оформление протоколов 10 минут
Составление тестов и кроссвордов по данной теме.
X Список используемой литературы:
Обязательная:
1. Биохимия. Учебник для вузов / Под ред. Е.С.Северина. М.:Гэотар-мед, 2003. 784 с.
2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, Москва, 1998. 740 с.
3. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. Под ред. проф. Е.С.Северина и проф. А.Я.Николаева. М.: Гэотар-мед, 2001. 441 с.
4. Строев Е.А. Биологическая химия. Москва, 1986.
5. Дзугкоева Ф.С., Калоева Л.А., Каряева Э.А., Гурина А.Е., Баллаева С.А. «Обмен веществ (учебно-методическое пособие)» с грифом Учебно -методическое объединение МЗ РФ, Владикавказ, 2003. 170 с.
Дополнительная:
Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И. Деев с соавт. // Итоги науки и техники, 2000. – Т. 29. - С. 151-167.
Евстигнеева Р.П. Витамин Е как универсальный антиоксидант и стабилизатор биологических мембран / Р.П. Евстигнеева, И.М. Волков, В.В. Чудинова // Биол. Мембраны, 2003. - № 2. С. 119-137.
Зборовская В.А. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме / В.А. Зборовская, М.В. Банникова // Вестник РАМН, 2000. - № 6. - С. 53-63.
Зенков Н.К. Окислительный стресс / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньщикова. - М.: Наука, 2004. - 343с.
Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высш. школа, 1998. - 293с.
Соловьева А.Г. Активность альдегиддегидрогеназы в эритроцитах, тромбоцитах и плазме крови крыс в норме и при ожоге / А.Г. Соловьева // Успехи соврем. Естествознания, 2007. - № 12. – С. 12-15.
Суханова Т.А Патохимия клетки / Т.А. Суханова // Успехи соврем. биологии, 2004. – Т. 40. – С. 82-104.
Шепелев А.П. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев, И.В. Корниенко, А.В. Шестопалов с соавт. // Вопр. мед. Химии, 2004. - № 2. - С. 15-17.
Наглядные пособия